張典，李齡佳，崔春*，劉鵬展，鄭雪君，許立鏘

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；2.廣東真美食品 股份有限公司，廣東 潮州 521000)

牡蠣又名生蠔、海蠣子等，其肉嫩味鮮，營養(yǎng)豐富，富含氨基酸、多不飽和脂肪酸、維生素以及礦物質(zhì)，有“海中牛奶”和“海之玄米”的美譽(yù)[1,2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)牡蠣及其提取物具有抑菌、降血脂、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性，因此在食品及藥用方面都具有極高的應(yīng)用價(jià)值[3-5]。但由于水產(chǎn)品存在較難保鮮、傳統(tǒng)加工技術(shù)利用率低的問題，牡蠣的高產(chǎn)值應(yīng)用及行業(yè)發(fā)展均受到了限制。因此，研究新型的深加工技術(shù)對牡蠣產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要[6]，在眾多的新型加工技術(shù)中，酶處理技術(shù)作用條件溫和，反應(yīng)過程易于控制且可以較好地保留氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，因此得到了廣泛的關(guān)注[7]。

當(dāng)前針對牡蠣多采用單酶水解法，酶解產(chǎn)物常常存在氨基酸態(tài)氮含量低、蛋白質(zhì)回收率不高等問題[8]。為解決以上問題，提高牡蠣蛋白質(zhì)的利用率，本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶協(xié)同的方法酶解牡蠣，并利用響應(yīng)面法獲得酶解過程的最佳工藝參數(shù)，以期為牡蠣的高效利用提供一定的理論依據(jù)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牡蠣：購自廣州黃沙海鮮水產(chǎn)市場；胰蛋白酶：酶活2.65×105U/g，廣州明遠(yuǎn)工貿(mào)有限公司；風(fēng)味蛋白酶：酶活500 LAPU/g，諾維信(中國)公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑：均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

善美SM-G21型絞肉機(jī) 廣州新域機(jī)電制造有限公司；THZ-82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；HYP-308消化爐、KDN-103F型微量凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；電子分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司；pH-3E pH計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

新鮮牡蠣去殼后，用絞肉機(jī)制成肉糜，將牡蠣肉糜與去離子水按照質(zhì)量比 1∶1的比例混合形成混合液備用。

1.3.2 牡蠣酶解

稱取一定量的牡蠣混合液于錐形瓶中，在自然pH[10,11]、特定的酶用量(%，胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶配比為3∶1)，特定的溫度下水浴震蕩酶解一定時(shí)間，反應(yīng)終止后在沸水浴中滅酶20 min。酶解液離心10 min(12000×g)，取上清液過濾，收集濾液，并測定其蛋白回收率和水解度[12,13]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在固定其他因素相同的條件下，分別考察各單因素酶用量(%)、酶解時(shí)間(min)和酶解溫度(℃)對蛋白質(zhì)回收率和蛋白質(zhì)水解度的影響[14]。

1.3.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化牡蠣酶解工藝

根據(jù)Box-Benhnken原理設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，以酶用量(%)、酶解時(shí)間(min)、酶解溫度(℃)為單因素試驗(yàn)的考察變量，以蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)回收率為優(yōu)化響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解條件，因素水平安排見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of response surface test

1.3.5 蛋白回收率和水解度的測定

使用凱氏定氮法測定原料和酶解液的總氮含量，用中性甲醛滴定法測定氨氮含量，蛋白回收率定義為牡蠣酶解液中的蛋白總量與原料蛋白總量的比值；水解度定義為牡蠣酶解液中的游離氨氮量與原料總氮量的比值[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量對酶解效果的影響

酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為6 h，酶用量對酶解效果的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同加酶量的酶解效果Fig.1 Enzymatic hydrolysis effect of different additive amount of enzyme

由圖1可知，酶添加量小于0.3%時(shí)，牡蠣酶解液的蛋白質(zhì)回收率和蛋白質(zhì)水解度隨酶添加量的增大而明顯升高，當(dāng)繼續(xù)增大酶添加量時(shí)，蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)回收率增長趨于平穩(wěn)，其原因可能是酶用量較低時(shí)，酶與底物結(jié)合較充分，蛋白質(zhì)水解程度隨酶添加量的增加而增大，而當(dāng)酶用量大于0.3%時(shí)，酶的濃度達(dá)到飽和，酶的作用效果也明顯減弱，因此，酶用量以0.3%為宜[16]。

2.1.2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

酶添加量為0.2%，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間對酶解效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶解時(shí)間的酶解效果Fig.2 Enzymatic hydrolysis effect of different enzymolysis time

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間從3～6 h，蛋白質(zhì)水解度和回收率呈明顯上升趨勢；在酶解時(shí)間達(dá)到6 h后，延長酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)酶解效果影響變小。其原因可能是在6 h,絕大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)充分水解[17]。因此，酶解時(shí)間以6 h為宜。

2.1.3 酶解溫度對酶解效果的影響

酶添加量為0.2%，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度對酶解效果的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶解溫度對酶解效果的影響Fig.3 Effect of different enzymatic temperatures on enzymatic hydrolysis effect

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度小于50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)水解度和回收率隨著溫度的升高而顯著增大；當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，部分蛋白酶失去活性，蛋白質(zhì)水解程度降低[18]。因此，酶解溫度以50 ℃為宜。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

使用Design Expert (Trial Version 8.0.5)來進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，總共有18個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為試驗(yàn)點(diǎn)，6個(gè)為中心點(diǎn)，以估算誤差。利用二次回歸方程對表2中18個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值和因素進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得到以下數(shù)學(xué)模型：

水解度Y1=35.83+3.58A-0.036B+3.97C-2.39AB+0.98AC-1.47BC-4.50A2-9.66B2-3.47C2。

蛋白質(zhì)回收率Y2=68.65+7.28A+8.50B+6.42C-3.42AB+5.58AC-3.03BC-10.61A2-11.40B2-10.00C2。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型分析結(jié)果見表3和表4。

表3 蛋白質(zhì)水解度的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Response surface quadratic model variance analysis of protein hydrolysis degree

表4 蛋白質(zhì)回收率的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Response surface quadratic model variance analysis of protein recovery rate

注：“*”代表5%顯著性水平，“**”代表1%顯著性水平，“***”代表0.1%顯著性水平。

由表3和表4可知，這2個(gè)模型的F值分別為185.28和50.21，對應(yīng)的P值均小于0.0001，說明這2個(gè)數(shù)學(xué)模型具有高度顯著性；失擬項(xiàng)(lack of fit)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率，上表中失擬項(xiàng)均大于0.05，說明模型失擬不顯著；模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2分別為99.52%和98.26%，表明有大約0.48%和1.74%的總量變異不能由模型進(jìn)行解釋；變異系數(shù)分別為2.63%和5.01%，說明數(shù)據(jù)離散程度?。?個(gè)模型的信噪比(Adeq Precision)均大于4。上述參數(shù)說明實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值之間具有很好的擬合度，這2個(gè)模型因素水平區(qū)間設(shè)計(jì)合理，可用于對牡蠣酶解物的制備工藝實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析、預(yù)測。對于蛋白質(zhì)水解度模型，A(加酶量)、C(時(shí)間)、AB、BC、A2、B2、C2對結(jié)果有極顯著性影響，AC有顯著影響，B(溫度)對蛋白質(zhì)水解度不顯著；對于蛋白質(zhì)回收率模型，A(加酶量)、B(溫度)、C(時(shí)間)、AC、A2、B2、C2對結(jié)果有極顯著影響，AB有顯著影響，BC對蛋白質(zhì)回收率不顯著。由F值和P值可知，一次項(xiàng)中，時(shí)間和加酶量對蛋白質(zhì)水解度影響最大，溫度影響最小，但溫度卻是影響蛋白質(zhì)回收率的最主要因素。由此可知，各個(gè)因素對蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)回收率的影響不是簡單的線性關(guān)系[19]，響應(yīng)曲面圖見圖4。

(a)溫度和加酶量對蛋白質(zhì)水解度的影響

(b)加酶量和時(shí)間對蛋白質(zhì)水解度的影響

(c)溫度和時(shí)間對蛋白質(zhì)水解度的影響

(d)溫度和加酶量對蛋白質(zhì)回收率的影響

(e)時(shí)間和加酶量對蛋白質(zhì)回收率的影響

(f)溫度和時(shí)間對蛋白質(zhì)回收率的影響

由圖4中(a)可知，隨著溫度和加酶量的升高，牡蠣酶解液的蛋白質(zhì)水解度逐漸上升，在50～53 ℃，加酶量在0.3%～0.4%之間蛋白質(zhì)水解度有最大值。由圖4中(b)可知，隨著酶解時(shí)間的增長，加酶量的增加，蛋白質(zhì)水解度逐漸變大，但是當(dāng)酶解時(shí)間超過7 h，加酶量超過0.4%時(shí)，蛋白質(zhì)水解度的增長趨于平緩；在整個(gè)酶解過程中，隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)水解度逐漸上升并趨于平緩，甚至有些下降。由圖4中(c)可知，溫度在50～53 ℃范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)水解度有最大值，隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白水解度先增加后趨于平緩。由圖4中(d)可知，隨著溫度的增加和加酶量的增大，蛋白質(zhì)回收率均呈上升趨勢，溫度在50～53 ℃，蛋白質(zhì)回收率有最大值，加酶量在0.4%后，蛋白質(zhì)回收率增長緩慢。由圖4中(e)可知，隨著酶解時(shí)間增加到一定值，牡蠣酶解液的蛋白質(zhì)回收率隨加酶量的添加呈現(xiàn)上升至平緩的趨勢，同樣的加酶量增大到一定值時(shí)，牡蠣酶解液的蛋白質(zhì)回收率隨酶解時(shí)間的延長增加到平緩。由圖4中(f)可知,牡蠣酶解液的蛋白質(zhì)回收率隨酶解溫度和酶解時(shí)間的增加到平緩。

利用軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面最優(yōu)化，在酶解溫度為50 ℃，胰蛋白酶添加量為0.3%(E/S)，酶解時(shí)間為6 h的條件下，將酶解液的蛋白水解度優(yōu)化目標(biāo)設(shè)定為maximize的最大值，將蛋白質(zhì)回收率優(yōu)化目標(biāo)設(shè)定為maximize的最大值得到蛋白質(zhì)回收率與蛋白質(zhì)水解度均高的牡蠣酶解工藝：酶解時(shí)間7.04 h,酶解溫度50.14 ℃，加酶量0.39%，此時(shí)蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)回收率分別為37.82%和71.87%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶法協(xié)同酶解牡蠣，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化牡蠣酶解工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明：采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化所得到的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度良好，具有一定的實(shí)際應(yīng)用和研究參考價(jià)值，結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際操作條件，其響應(yīng)面優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為：酶解時(shí)間7.04 h,酶解溫度50.14 ℃，加酶量0.39%，此時(shí)蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)回收率分別為37.82%和71.87%。