戚馨月，田興國，汪海峰，周建新

(南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

食品由于微生物污染，常會腐敗變質(zhì)而造成直接經(jīng)濟損失或者引發(fā)消費者健康問題，向食品中加入防腐劑是一種簡單有效的方法[1]。隨著生活水平的不斷提高，人們對食品的安全、營養(yǎng)、保健性也提出了更高的要求，傳統(tǒng)化學(xué)合成防腐劑的使用受到挑戰(zhàn)或限制。因此具有抗菌性強、安全無毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等特點的天然防腐劑的研究和開發(fā)成為食品科學(xué)的研究熱點。食品天然防腐劑按其來源可分為三類，即植物源、微生物源和動物源。其中植物源食品天然防腐劑是在植物的根、莖、葉、花和果實等中提取出來的具有良好抗菌性能的液態(tài)或半固態(tài)混合物，在人體消化道內(nèi)可降解，不影響消化道菌群的生長，同時還具有一定的營養(yǎng)、保健價值，即在發(fā)揮抗菌和食品保鮮作用的同時，還具有抗氧化、降血脂、降血壓、預(yù)防腫瘤等防病保健的功能。同時我國植物資源豐富多樣，藥食兩用資源及傳統(tǒng)的調(diào)味料植物資源符合我國居民的飲食習(xí)慣，安全性相對化學(xué)合成防腐劑高，容易被消費者接受，可滿足人們對天然食品、綠色食品、健康食品的需要，因此，開發(fā)安全、高效、經(jīng)濟、營養(yǎng)的植物源天然食品防腐劑是食品天然防腐保鮮領(lǐng)域的優(yōu)先方向[2]。

我國是花生主要生產(chǎn)國之一，據(jù)統(tǒng)計，我國花生年產(chǎn)量超過1400萬噸，按含殼量33%計算，每年大約有450噸的花生殼，花生除榨油外也逐漸被開發(fā)成一些調(diào)味品應(yīng)用于食品中，花生殼是花生果加工食品、食用油脂的廢棄物，除含有65.7%～79.3%的纖維素、木質(zhì)素外，還含有少量的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖以及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分；此外，還含有3.34%～7.13%的多酚類化合物[3]，其中花生殼提取物的有效成分以木犀草素為主的黃酮類化合物，此類化合物在體內(nèi)具有抗氧化性、增強免疫功能、降血脂、降膽固醇和抗炎癥等藥理作用[4]。

近十幾年來，花生殼提取物在食品的抗氧化與抗菌活性方面得到了大量研究，顯示其具有良好的抗氧化與抗菌活性。汪海峰等[5]對花生殼甲醇粗提取物成分進行分析，其中主要的黃酮類化合物木犀草素的含量達12.6%。陳春濤等[6]通過粗提、溶劑梯度萃取、配合抑菌活性跟蹤檢測，得到了抑菌活性較強、富含黃酮類的花生殼乙酸乙酯組分，并用酸堿沉淀、柱層析等方法純化得到3種化合物。于亞莉[7]用花生殼多酚提取物(PPS)對脂肪酶進行體外抑制作用，其抑制率在0.29 mg/mL時可達41.5%，同時花生殼中多酚提取物對胰脂肪酶具有競爭性抑制作用。由于目前我國的花生殼大部分用作燃料，其余作為廢渣被棄去，因此花生殼作為一種價廉、可再生的資源，是提取食品天然抗氧化劑和防腐劑的理想原料，具有廣闊的應(yīng)用前景[8]，而且在果蔬保鮮，調(diào)味品、海鮮、熟食等食品的防腐抑菌方面對天然無毒的抑菌劑有著迫切的需求。然而，目前的研究只說明了花生殼提取物具有一定的抗氧化和抑菌能力，但對于其抗細(xì)菌作用差異性的研究較少，本文研究了花生殼乙醇提取物對食品中常見污染菌的抑制作用，并分析了其差異性。旨在為將其開發(fā)成高效、低毒的天然食品防腐劑提供依據(jù)，在調(diào)味品防腐抑菌方面，對天然抑菌劑和食品的保鮮等有重要的意義，使其更廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域中。

1 材料與方法

1.1 材料

花生殼：選取產(chǎn)自吉林省松原市的優(yōu)質(zhì)花生，手工剝殼并去除發(fā)黑、有蟲洞的次品。將花生殼清洗瀝干后置于50 ℃烘箱中烘干4 h，粉碎過40目篩，密封袋保存。

實驗菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，江蘇省疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠。各菌種分別接入肉湯(LB)培養(yǎng)基，(36±1) ℃培養(yǎng) 24 h進行活化，用LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度為106～107cfu/mL作為原菌懸液，用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個梯度的菌懸液，用于抗菌活性測定。

實驗試劑：氯化鈉(分析純)、無水乙醇(99%)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；肉湯培養(yǎng)基(LB)、平板計數(shù)瓊脂(PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)：250 g，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；去離子水：實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQTY-70S型低溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司；FW100型高速粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；BSC-1300 Ⅱ A2型生物安全柜 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DHP型電熱恒溫培養(yǎng)箱 金壇市醫(yī)療儀器廠；101-34S型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海蘇進儀器設(shè)備廠；LDZX-50FBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；鍍鉻游標(biāo)卡尺(0～150 mm) 桂林量具廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生殼乙醇提取物(EEPH)的制備(水浴回流法)

選擇乙醇為有機溶劑結(jié)合回流法對花生殼粉進行提取，提取工藝：85 ℃水浴回流，70%乙醇，料液比1∶20，提取2次，每次1.5 h。合并濾液，旋蒸至浸膏狀，用50%的乙醇溶液定容，得到花生殼乙醇提取液(EEPH)。按此操作分別制得0.2，0.4，0.8，1.6 g/mL的花生殼乙醇提取液(原料花生殼/定容體積，g/mL)備用。

1.3.2 平板計數(shù)法測定花生殼乙醇提取物的抑菌率

在無菌培養(yǎng)皿中加入1 mL上述不同濃度和菌種的菌懸液，在PCA培養(yǎng)基中加入相應(yīng)體積的0.2 g/mL EEPH，使其體積分?jǐn)?shù)分別為1.25%、2.5%、3.75%，傾注平板，混勻，以50%乙醇作為對照組，36 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

抑菌率的計算方法：

1.3.3 濾紙片法測定花生殼乙醇提取物的抑菌圈

將滅菌后直徑為6 mm的濾紙片浸泡于不同EEPH濃度(0.2，0.4，0.8，1.6 g/mL)和50%乙醇(對照)中3 h，取出瀝干。取0.1 mL不同濃度、不同菌種的菌懸液，均勻涂布于PCA平板上，將上述濾紙片3個為一組呈正三角形平鋪皿中，36 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.3.4 花生殼乙醇提取物對實驗菌生長曲線的影響

取10支無菌試管，按0，4，8，12，16，20，24，28，32，36 h編號，配制含0.4 g/mL EEPH的LB培養(yǎng)基，調(diào)整EEPH的體積分?jǐn)?shù)為5%，每支試管加入9 mL，并加入1 mL不同菌種的原菌懸液，以不加花生殼乙醇提取液的LB培養(yǎng)基作為空白對照，36 ℃搖床培養(yǎng)，并按時將試管取出，4 ℃保存。對樣品做適宜10倍稀釋，平板計數(shù)法計數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 基于平板計數(shù)法的花生殼乙醇提取物的抑菌率

EEPH 對實驗菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制率見表1。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)的花生殼乙醇提取物 對不同濃度、不同菌種的抑菌率Table 1 Antibacterial rates of EEPH with different volume fractions for different strains with different content

注：與空白對照組比較，“*”表示P<0.05；“**”表示 P<0.01；“***”表示 P<0.001。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

在相同提取物和實驗菌濃度下，EEPH可顯著抑制實驗菌種的生長，金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，最高可完全抑制，大腸桿菌次之，枯草芽孢桿菌較弱。通過SPSS 21.0軟件進行方差分析(見表2)，可知實際F(實驗菌種)=45.08，F(xiàn)(提取物濃度)=33.98，F(xiàn)(菌濃度)=8.65，均大于查表所得的F值F0.05(2,4)=6.24，F(xiàn)0.05(1,4)=7.71。因此，實驗菌種類與抑菌率具有顯著性關(guān)系。當(dāng)菌濃度一致時，其EEPH的體積分?jǐn)?shù)與抑菌率之間呈正相關(guān)，其抑制效果與提取物存在一定的劑量效應(yīng)。當(dāng)提取物體積分?jǐn)?shù)一定時，菌濃度與抑菌率之間同樣具有顯著性關(guān)系，對低濃度菌液的抑制較敏感。通過分析菌種、提取物的體積分?jǐn)?shù)與菌濃度3個因素的交互作用，可知實際F(提取物體積分?jǐn)?shù)-菌種)=4.48，F(xiàn)(提取物體積分?jǐn)?shù)-菌濃度)=0.78，小于查表所得的F值F0.05(4,4)=6.39，F(xiàn)0.05(2,4)=6.24，實際F(菌種-菌濃度)=18.28，大于查表所得F值 F0.05(2,4)=6.24，表明菌種和菌懸液的交互作用與抑菌率之間存在顯著性差異。

2.2 基于濾紙片法的花生殼乙醇提取物的抑菌圈

對于不同濃度花生殼乙醇提取液作用于不同菌種而形成的抑菌圈直徑實驗，統(tǒng)計結(jié)果見表3。EEPH對3個菌種均有抑制作用，在相同提取物和實驗菌濃度下,其抑菌圈大小為：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最大，抑菌圈可達到19 mm，其次為大腸桿菌，最后為枯草芽孢桿菌，抑菌效果同平板計數(shù)法相同。通過SPSS 21.0軟件進行方差分析(見表4)，可知實際F(實驗菌種)=130.57,F(提取物濃度)=31.16，F(xiàn)(菌濃度)=18.80，均大于查表所得的F值F0.05(2,6)=5.14，F(xiàn)0.05(3,6)=4.76，F(xiàn)0.05(1,6)=5.99。因此，抑菌圈的大小與菌株的種類顯著相關(guān)。當(dāng)菌液濃度一致時，EEPH對抑菌圈直徑隨提取液濃度增加而增大，呈顯著正相關(guān)。當(dāng)提取物濃度一定時，抑菌圈大小隨提取物濃度減小而增大，呈顯著負(fù)相關(guān)。通過分析菌種、提取物濃度與菌濃度3個因素的交互作用，可知實際F(提取物濃度-菌種)=4.26，F(xiàn)(提取物濃度-菌濃度)=3.75，小于查表所得的F值F0.05(2,6)=5.14 ，F(xiàn)0.05(6,6)=4.28，實際F(菌種-菌濃度)=5.08，大于查表所得的F值F0.05(3,6)=4.76，表明菌種和菌濃度的交互作用與抑菌圈直徑之間具有顯著性差異，即與抑菌效果有顯著關(guān)系。

表3 花生殼乙醇提取物對不同濃度、不同菌種抑菌圈(mm)的影響Table 3 Effect of EEPH on inhibition zones(mm)of different strains with different content

注：與空白對照組比較，“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01；“***”表示P<0.001。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.3 花生殼乙醇提取物對實驗菌種生長曲線的影響

花生殼乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌生長曲線的抑制作用結(jié)果見圖1。

圖1 花生殼乙醇提取物對不同菌種 生長曲線的影響Fig.1 Effect of EEPH on growth curve of different strains

對于大腸桿菌，不加EEPH的空白對照組，很快進入了對數(shù)生長期，供試菌大量繁殖，菌體個數(shù)迅速增長，在16 h時細(xì)菌增長緩慢，進入平穩(wěn)期，而實驗組在12 h時結(jié)束對數(shù)生長期，保持平穩(wěn)生長，并在28 h時開始衰退。對于枯草芽孢桿菌，空白組在前期菌落生長迅速，于16 h時達到最大值，而實驗組在12 h時進入穩(wěn)定期，生長略有波動。對于金黃色葡萄球菌，實驗組相比空白組抑制作用較明顯，空白組在0～8 h有明顯的對數(shù)生長期，菌落數(shù)最高可達1.89×108，而實驗組未出現(xiàn)明顯的對數(shù)生長期，并在20 h時開始衰退。總體而言，與空白組相比，實驗菌實驗組生長曲線變化明顯，曲線趨勢較平緩，對數(shù)期時間滯后于空白組，且對數(shù)期峰值較低。以上結(jié)果表明，EEPH可有效地縮短對數(shù)生長期，抑制菌體的生長，達到抑制作用。抑菌效果為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。

3 結(jié)論

通過平板計數(shù)法、濾紙片法和生長曲線法測定了花生殼乙醇提取物(EEPH)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抗菌活性的差異性。結(jié)果表明，在相同EEPH和實驗菌濃度下，比較抑菌率、抑菌圏和生長曲線對數(shù)生長期峰值，抗菌活性為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。對同一菌種的抑菌率或抑菌圈與EEPH和菌濃度呈顯著的劑量效應(yīng)，與EEPH濃度呈顯著正相關(guān)，與菌濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。加入EEPH的生長曲線對數(shù)期時長滯后于對照組，實驗中組可縮短為8～12 h，尤其是金黃色葡萄球菌，幾乎完全抑制，且峰值顯著降低，菌落數(shù)可下降2～3個數(shù)量級。進一步方差分析表明，菌種、EEPH濃度、菌濃度以及菌種和菌濃度2個因素的交互作用與其抑菌率或抑菌圈之間顯著相關(guān)。

花生殼提取物的有效成分以木犀草素為主的黃酮類化合物[9]。黃酮類化合物對細(xì)菌的抑制效果明顯，抗菌活性可能由于它們可以與細(xì)胞外可溶性蛋白、細(xì)胞膜形成復(fù)合物，許多親脂類黃酮還可能破壞微生物的細(xì)胞膜[10]。對數(shù)生長期是細(xì)菌細(xì)胞分裂的主要時期,也是核酸、蛋白質(zhì)合成的主要時期,因此，根據(jù)本研究結(jié)果可推測花生殼乙醇提取物對菌體的抑制作用可能是通過抑制菌體核酸或者蛋白的合成，從而抑制菌體的分裂和增殖[11]。本實驗的結(jié)果不僅為花生殼作為天然抑菌防腐劑提供了理論支持，還有利于農(nóng)產(chǎn)品廢物的綜合利用，減少了環(huán)境污染。