隋明，張鳳英，唐賢華，吳霞，王靜霞，牛廣財(cái)

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830;2.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院， 成都 610065；3.奧克蘭大學(xué) 醫(yī)學(xué)與健康科學(xué)學(xué)院，新西蘭 奧克蘭 1052)

醬油和食醋已經(jīng)是現(xiàn)代生活中人們?cè)谂腼儾穗葧r(shí)必不可少的2種調(diào)味品，隨著生活水平的提高，在滿足衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的前提下其豐富的香氣和口感提升了菜品的口味。醬油和食醋的另一個(gè)功能是增加食物的營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)一步提升食欲，甚至目前已經(jīng)出現(xiàn)了保健醋、低鹽醬油等[1，2]。通過了解醬油和食醋的生產(chǎn)情況與發(fā)酵技術(shù)，可以進(jìn)一步了解這2種物質(zhì)的香氣成分，對(duì)其測(cè)定和技術(shù)鑒定具有一定幫助。

1 醬油、食醋概述

1.1 醬油概述

史游《急就篇》中有關(guān)于古人將大豆、小麥作為基礎(chǔ)原料制作豆醬的記錄；《齊民要術(shù)》中也有關(guān)于醬油生產(chǎn)的很多記載；另外，孫思邈《千金方》中也有關(guān)于使用醬油治療疾病方面的醫(yī)療方法[3]。醬油是以大豆、小麥為主要原料以及麩皮、稻殼等副產(chǎn)品為輔料經(jīng)過制曲、發(fā)酵、蒸煮后產(chǎn)生的一種液體調(diào)味產(chǎn)品。我國(guó)的大豆栽培種植產(chǎn)業(yè)以及相關(guān)加工行業(yè)的歷史發(fā)展幽遠(yuǎn)流長(zhǎng)，而醬油作為中華民族最為傳統(tǒng)的大豆制品，在調(diào)味品方面具有十分深厚的基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)顯示，中國(guó)醬油的起源應(yīng)該是豆醬，最早有關(guān)醬油的典籍也可以追溯至西漢?，F(xiàn)今我國(guó)已經(jīng)成為醬油產(chǎn)銷量最高的國(guó)家，年產(chǎn)量超過500萬噸，從品種、花色和檔次等方面都呈現(xiàn)出百花齊放的態(tài)勢(shì)。中國(guó)醬油從產(chǎn)地可以劃分四類，分別是廣東海天醬油，粵產(chǎn)醬油，李錦記等外資醬油，滬產(chǎn)醬油。

有關(guān)醬油、食醋根據(jù)揮發(fā)性組分確定不同品類、級(jí)別的研究技術(shù)，研究水平相對(duì)滯后，目前更多的將研究側(cè)重點(diǎn)放在提高蛋白質(zhì)利用度以及縮短釀造時(shí)間兩方面，而不同工藝、微生物群落對(duì)有關(guān)香氣成分分析方面的研究不足[4，5]。

1.2 食醋概述

食醋作為一種主要調(diào)節(jié)酸性口感的調(diào)味品，按照生產(chǎn)方式可以分為釀造食醋(價(jià)格高)和配制食醋(醋精勾兌而成，價(jià)格便宜)。釀造食醋的主要原料是富含淀粉的糧食作物，南方主要以大米、糯米為主，而北方主要以高粱和小米為主。隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)食醋口味、香氣的要求提高，現(xiàn)代釀造食醋都需要加入糧食作物輔料，如馬鈴薯、番薯、紅薯、木薯等，通過淀粉糖化、乙醇發(fā)酵以及醋酸發(fā)酵等程序，最終形成具有酸、甜、咸、鮮味道的調(diào)味品。目前也出現(xiàn)了很多保健醋，比如抗氧化、抗菌、抗腫瘤、降低體脂、減少膽固醇[6-8]以及增加其他保健功能性物質(zhì)的食醋。

食醋產(chǎn)生時(shí)間久遠(yuǎn)，可以與釀酒歷史相提并論，正是在反復(fù)釀造酒質(zhì)變酸的過程中人類開始掌握了釀醋技藝。本研究在對(duì)食醋香氣成分分析過程中鑒定了相應(yīng)產(chǎn)品中出現(xiàn)的多種特征型指紋峰物質(zhì)中，確定了不同品類食醋的指紋圖譜，基于固相微萃取方式可以對(duì)傳統(tǒng)樣品類型進(jìn)行技術(shù)處理，基于此建立更加完善的食醋香氣檢測(cè)、加工工藝以及不同微生物群落對(duì)食醋風(fēng)味的影響[9]，以期對(duì)未來食醋釀造工藝水平提升提供幫助。

2 材料及儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

醬油樣品：閬中閬州手工醬油、古龍古早醬油、欣和六月鮮生抽、配制醬油等；

食醋樣品：陜西寧化府老陳醋、欣和醯官醋、四川閬中手工醋、北京米醋、配制食醋等。

2.2 試劑

4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醇和羥基-2-(5)-乙基-5-(2)-甲基-3(2)呋喃酮：均為色譜純,購(gòu)于中國(guó)上海生工集團(tuán)。

主要儀器包括：氣相色譜儀(GC-88900)、氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS-6800)、水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、微量進(jìn)樣器(10 μL)等。

本研究中選取的玻璃器皿采用二次回收有機(jī)溶劑進(jìn)行洗滌，并對(duì)器皿殘留物進(jìn)行去除，隨后使用洗衣粉溶劑采取浸泡方式，去除表面殘留雜質(zhì)和油漬等物質(zhì)。隨后，使用2%鹽酸、重鉻酸鉀溶液進(jìn)行浸泡(2 h)，最后使用蒸餾水進(jìn)行沖洗。使用烘箱在110 ℃條件下烘干(4 h)后備用。其他器材也采用相同方法進(jìn)行處理，并倒置晾干。

3 醬油及食醋香氣成分測(cè)定分析

3.1 萃取頭老化

實(shí)驗(yàn)中，在使用萃取頭前應(yīng)當(dāng)進(jìn)行老化處理，采取85 μm PA和100 μm PDMS進(jìn)行老化處理，時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為2 h，溫度條件為250 ℃。

3.2 色譜條件分析

本實(shí)驗(yàn)中使用的色譜柱是PEG-20M彈性石英毛細(xì)管柱，設(shè)置初始柱溫為55 ℃，且在恒溫2 min條件下以3.5 ℃/min將溫度重新提升到120 ℃，維持1 min，隨后以6 ℃/min將溫度提升至200 ℃，并維持溫度。使用的載氣為高純氮，氫氣流量調(diào)整為20 mL/min，空氣流量應(yīng)控制在300 mL/min，經(jīng)過FID檢測(cè)，進(jìn)樣口溫度應(yīng)達(dá)到230 ℃，且不存在分流模式。

質(zhì)譜條件：EI源，EMV 800 V，此時(shí)的掃描范圍應(yīng)當(dāng)達(dá)到33～300 amu，電子能量需要達(dá)到70 eV,并通過全掃描方式完成。

3.3 醬油、食醋的香氣成分測(cè)定

3.3.1 內(nèi)標(biāo)物的設(shè)計(jì)

在選擇過程中應(yīng)當(dāng)把握幾點(diǎn)原則：樣品中不包含此類化合物；內(nèi)標(biāo)的選擇需要與對(duì)應(yīng)的化學(xué)分子之間具有空間結(jié)構(gòu)或者類別具有相似性；內(nèi)標(biāo)峰以及被測(cè)峰出峰時(shí)間具有相近特征。

通過測(cè)試，乙酸正戊酯設(shè)定為內(nèi)標(biāo)，此時(shí)選擇乙酸正戊酯含量2 mL，將其添加入100 mL容量中，并采用乙醇(60%含量)定容，此時(shí)可以獲得內(nèi)標(biāo)物175.8 mg/L的濃度含量。

3.3.2 醬油混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和校正因素測(cè)量分析

根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，醬油香氣組分中乙醇含量較高，且香氣成分標(biāo)樣顯示無法與水相融，則此時(shí)20%的乙醇溶液作為基質(zhì)，可以完成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。此時(shí)，選定20種香氣組，每組組分選擇其中50 μL，添加入100 mL容量瓶中進(jìn)行定容，并完成儲(chǔ)備液的配比制作，形成0.5 mL/L比例的溶液。

在校正因子過程中，需對(duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行10倍稀釋，則此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)液濃度是0.05 mL/L。

將乙酸正戊酯作為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)將內(nèi)標(biāo)物和標(biāo)樣混合，獲得1 μL添加入10 mL醬油樣品中，此時(shí)可以通過相對(duì)校正因素賦值方式進(jìn)行計(jì)算。

3.3.3 食醋標(biāo)樣配制

通常而言，總酸在食醋中的含量能夠達(dá)到3.5 g/mL，而更多的是乙酸，幾乎可以達(dá)到食醋中絕對(duì)比例，為了能夠保證食醋標(biāo)準(zhǔn)樣品中成分一致，選擇乙酸溶液作為溶劑完成配比。本次實(shí)驗(yàn)選擇24種香氣組分，并每組取樣50 μL，采取3.5 mL/dL的乙酸溶劑定容。

3.3.4 醬油和食醋香氣成分定性分析

本次研究中主要選擇的是氣相色譜-質(zhì)譜定性分析方式，確定了匹配度高于85%，采取標(biāo)樣核對(duì)方式對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，并通過內(nèi)標(biāo)法完成定量。

3.3.5 醬油、食醋香氣成分定量分析

本次實(shí)驗(yàn)中將不同品牌的醬油、食醋抽樣中揮發(fā)性組分進(jìn)行含量計(jì)算，依據(jù)組分峰面積以及內(nèi)標(biāo)峰面積的測(cè)定，計(jì)算出各組分中揮發(fā)性組分實(shí)際含量情況。

圖1 醬油取樣氣相色譜圖Fig.1 Sampling gas chromatography of soy sauce

圖2 食醋取樣氣相色譜圖Fig.2 Sampling gas chromatography of vinegar

4 醬油和食醋生產(chǎn)工藝鑒定與質(zhì)量控制

為確保實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性與數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)樣品中揮發(fā)性組分的數(shù)據(jù)分析，均充分依據(jù)質(zhì)量保證與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系。在具體執(zhí)行過程中控制幾個(gè)方面的工作，質(zhì)量保證實(shí)施需要建立具有可行性的操作系統(tǒng)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確與嚴(yán)格，目的是能夠?qū)κ褂谜咛峁?zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)。為此，在提取醬油和食醋揮發(fā)性組分過程中應(yīng)當(dāng)提取徹底，嚴(yán)格按照頂空提取操作完成，確保正確的操作流程，對(duì)樣品的采集及有效保管，針對(duì)儀器設(shè)備的有效維護(hù)，對(duì)人員組織相關(guān)負(fù)責(zé)人的結(jié)構(gòu)搭配等。質(zhì)量控制過程中包括了對(duì)過程和數(shù)據(jù)的控制。數(shù)據(jù)質(zhì)量目標(biāo)則需要充分考慮精密度、準(zhǔn)確性、代表性和完整性。

4.1 樣品前處理流程工藝控制

針對(duì)確定樣品前的處理操作規(guī)范如下：依據(jù)相關(guān)流程實(shí)施萃取富集、分離純化以及濃縮定容操作。另外，對(duì)不同目標(biāo)化合物則需在不同環(huán)境基質(zhì)條件下進(jìn)行不同技術(shù)處理，例如在對(duì)飲用水樣品進(jìn)行處理過程中，通常省略純化操作，而是脫水處理。結(jié)合目標(biāo)化合物可以選擇替代化合物，確定更加符合實(shí)際需要的替代化合物類型；前提應(yīng)當(dāng)是非目標(biāo)化合物，環(huán)境樣品中包括了罕有的檢出類型，物質(zhì)結(jié)構(gòu)需相似，最好是同位素標(biāo)定。方法空白則具體是指實(shí)驗(yàn)室試劑以及現(xiàn)場(chǎng)試劑空白，LRB需要對(duì)空白水樣本實(shí)施實(shí)驗(yàn)，且在實(shí)驗(yàn)過程中主要依據(jù)的是國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)樣品具體的操作規(guī)范，其中包括了對(duì)各類型器皿，如玻璃瓶、儀器設(shè)備等。在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中的樣品相關(guān)操作流程也需要考慮使用目標(biāo)化合物和相關(guān)分析，F(xiàn)RB則需要通過對(duì)空白水樣的采集和依據(jù)整個(gè)樣品前處理操作辦法執(zhí)行具體流程，其中包括對(duì)樣點(diǎn)采集、運(yùn)輸和相關(guān)流程的分析。

4.2 儀器分析階段的工藝控制分析

需增加內(nèi)標(biāo)化合物。依據(jù)目標(biāo)化合物可以增加一定的內(nèi)標(biāo)化合物，但是此類內(nèi)標(biāo)化合物不能與目標(biāo)化合物的性質(zhì)相似。本次研究中醬油和食醋香氣成分主要采取乙酸正戊酯作為主要的內(nèi)標(biāo)化合物，為此，測(cè)定相對(duì)校正因子的過程中，對(duì)所有分析樣品均需要進(jìn)行添加。

校正質(zhì)量控制分析。在對(duì)樣品進(jìn)行技術(shù)分析之前，需采取校正空白操作，也就是溶劑空白處理，對(duì)前一日工作中產(chǎn)生的樣品雜質(zhì)進(jìn)行處理，確保實(shí)驗(yàn)中不再出現(xiàn)雜質(zhì)。

隨后，通過內(nèi)標(biāo)峰面積方法構(gòu)建校正曲線，此時(shí)在進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中RF值所產(chǎn)生的相對(duì)偏差不應(yīng)當(dāng)高于20%。此外，還需要進(jìn)行日校對(duì)，并進(jìn)行校正審核。使用已經(jīng)建立的校正曲線測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果偏差高于20%，則日校正不符合標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)重新校對(duì)校正曲線。

5 結(jié)果與討論

通過使用內(nèi)標(biāo)法確定的內(nèi)標(biāo)曲線圖見圖3，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9990，符合標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。不同品牌的食醋共有的揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)據(jù)見表1，王芮東等[10]使用HPLC測(cè)定食醋中的有機(jī)酸成分，結(jié)果顯示：陳醋、香醋中的有機(jī)酸種類要比果醋中的成分更加豐富。

圖3 內(nèi)標(biāo)校正曲線的建立Fig.3 Establishment of calibration curve for internal standard

表1 食醋中揮發(fā)性組分的含量Table 1 Content of volatile compounds in vinegar

注：“*”表示單位為mg/mL。

Castro Mejías R等[11]采用頂空固相微萃取技術(shù)對(duì)醋中芳香化合物進(jìn)行分析。結(jié)果表明：包覆羧基-聚二甲硅氧烷的二氧化硅纖維比包覆聚二甲硅氧烷、碳-二乙烯基苯、聚二甲硅氧烷-二乙烯基苯的二氧化硅纖維具有更好的萃取效果，但重復(fù)性較差。門戈陽等[12]采用GC-MS法對(duì)醋酸發(fā)酵過程中的芳香族化合物組分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:醋中芳香成分有19種，主要是醇和酸的結(jié)構(gòu)成分，占全部芳香成分總含量的80%以上。通過氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定得到的數(shù)據(jù)，手工固態(tài)發(fā)酵醋的香氣成分達(dá)60種以上，而采用液態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)工藝香味種類只有前者的一半左右，通過醋精調(diào)配的食醋揮發(fā)性組分不超過22種，與閻玉林[13]的研究結(jié)果基本一致，這也說明采用固態(tài)發(fā)酵法釀造的醬油香氣成分最豐富。

由表2可知，不同品牌的醬油揮發(fā)性組分所含有的有機(jī)酸、醇類、酯類、雜環(huán)類化合物只是品類不同及工藝不同導(dǎo)致含量出現(xiàn)變化，釀造醬油無論時(shí)間長(zhǎng)短，微生物配比，典型的揮發(fā)性香氣物質(zhì)基本一致，而配制醬油的香氣含量明顯很低，而且苯環(huán)類防腐劑含量較高，這同黃毅[14]的研究結(jié)論一致。

表2 醬油的揮發(fā)性組分的含量Table 2 Content of volatile compounds in soy sauce

注：不同字母表示用Duncan檢驗(yàn)法所得不同的顯著性，P<0.05 (n=3)。

綜上所述，通過對(duì)比前人的研究成果，本研究針對(duì)醬油、食醋的香氣成分進(jìn)行分析，確定了產(chǎn)品的品質(zhì)，并總結(jié)了以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：首先，依據(jù)HS-SPME-GC香氣測(cè)定方式，檢驗(yàn)12類酯類，效果明顯，利用此方法進(jìn)行香氣測(cè)定，可以有效分辨產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣。其次，采取氣相色譜法針對(duì)醬油、食醋香氣中主要成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)萃取頭種類、時(shí)間、溫度等條件參數(shù)完成了優(yōu)化，采取本方法的樣品回收率高，效果明顯。另外，也具體分析了生產(chǎn)工藝水平，希望能夠?qū)M(jìn)一步加強(qiáng)與完善醬油和食醋生產(chǎn)工藝水平提供借鑒和幫助。