孫美濤，梅 雯，王唯斯，李素芬，自加吉，張曉娟，熊 偉

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的原發(fā)性惡性腫瘤，約占成人原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的30%~40%，多數(shù)腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，侵襲性強［1］。目前，腦膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，但因腫瘤浸潤性生長的特點，導(dǎo)致手術(shù)治療不能徹底切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，患者的預(yù)后極差，因而多需要術(shù)后結(jié)合放化療的綜合性治療［2］。隨著對腦膠質(zhì)瘤的深入研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤的生長侵襲與多種基因密切相關(guān)，基因靶向治療可能是治療腦膠質(zhì)瘤的一種有效方法［3］。腦膠質(zhì)瘤的一個重要的生物學(xué)異常表現(xiàn)是能量代謝的改變，從而使腫瘤細胞保持更強的增殖、侵襲及在不利環(huán)境中存活的能力［4］。其能量代謝的特征是，即使在有氧的條件下也主要采用糖酵解的方式產(chǎn)生能量，這一過程受一系列的基因調(diào)節(jié)，并促使腫瘤細胞表現(xiàn)出惡性特征［5］。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是環(huán)境致癌物作用的重要靶標(biāo)，其損傷程度和突變率顯著高于核內(nèi)DNA［6］。大量研究表明，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的mtDNA突變和線粒體動力學(xué)改變有明顯相關(guān)［7，8］。

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3（mitochondrial transcription termination factor 3，MTERF3） 又被命名為線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1（mitochondrial transcription termination factor domain containing 1，MTERFD1），是 MTERF 蛋白家族中最保守的成員［9］。人MTERF3基因位于 8q22.1，包含 11個外顯子［10］。研究顯示，哺乳動物MTERF3是一種線粒體蛋白質(zhì)，且負調(diào)控線粒體DNA的基因表達和線粒體能量生成［11］。動物實驗證明，MTERF3在小鼠胚胎發(fā)育過程中不可缺少，敲除MTERF3基因的小鼠胚胎發(fā)育遲緩并在妊娠過程中死亡［11］。還有研究報道，MTERF3基因在細胞中的作用類似于細胞癌基因，MTERF3基因拷貝數(shù)擴增及其過表達對肝細胞癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進展和預(yù)后有重要作用［12］。然而，目前關(guān)于MTERF3基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制仍不清楚。該研究通過構(gòu)建MTERF3過表達的腦膠質(zhì)瘤U251細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，旨在探究MTERF3對U251細胞線粒體基因表達及細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤U251細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；pEX-EGFP-Flag和pEX-MTERF3-Flag質(zhì)粒購自廣州復(fù)能基因有限公司；胰酶消化液、DMSO、D-PBS、青鏈霉素溶液、碘化丙啶（PI）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光液、XTT細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DL 2000 DNA Marker、基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；Tranwell小室購自美國Corning公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購自美國Roche公司；兔抗MTERFD1多克隆抗體（ab167067）、兔抗GAPDH多克隆抗體 （ab9485）、兔抗 VDAC1多克隆抗體（ab15895）、兔抗 MT-ND1 多克隆抗體（ab222892）、兔抗MT-ND6多克隆抗體 （ab81212）、兔抗MTCYB多克隆抗體 （ab81215）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ab6721）購自美國Abcam公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人腦膠質(zhì)瘤U251細胞用含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將實驗對象分為3組，空白對照組：無轉(zhuǎn)染的U251細胞；陰性對照組：轉(zhuǎn)染pEGFPFlag質(zhì)粒的U251細胞；實驗組：轉(zhuǎn)染MTERF3-Flag質(zhì)粒的U251細胞。取處于增殖期的U251細胞，待其生長至匯合度為80%～90%進行細胞轉(zhuǎn)染。使用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染4~6 h后更換Opti-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)轉(zhuǎn)染至48 h，觀察轉(zhuǎn)染效率，拍片。然后用500 μg/ml G418篩選14 d，獲得穩(wěn)定表達株，擴大培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 半定量PCR檢測線粒體DNA拷貝量變化按細胞基因組DNA提取試劑盒說明書進行細胞總DNA的提取。為減少DNA模板量的差異，擴增核基因組18 S rDNA基因，引物設(shè)計如下：18 S rDNAF：5'-CGCGCTCTACCTTACCTACC-3'，18 S rDNAR：5'-CCGTCGGCATGTATTAGCTC-3'，調(diào)整各樣品模板濃度。以調(diào)整一致的模板濃度，擴增mtDNA的D-loop區(qū)片段，對mtDNA拷貝量進行相對定量，引物設(shè)計如下：D-loop-F：5'-GGGAACGTGTGGGCTA TTTA-3'，D-loop-R：5'-TACTCAAATGGGCCTGT CCT-3'。進行3次獨立實驗，凝膠成像系統(tǒng)成像，QuantityOne 4.6軟件 （Bio-rad）分析個條帶灰度值，以線粒體D-loop與18S rDNA的擴增條帶的灰度值比值代表線粒體DNA拷貝量變化［13］。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達水平 取以上3組的U251細胞，每孔分別加入150 μl Western IP細胞裂解液（含1.0 mmol/L PMSF），置于冰上30 min，使其充分裂解。12 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到各自標(biāo)注好類別的1.5 ml的Eppendorf管內(nèi)，BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性。各組取100 μg樣品進行上樣，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉室溫下對PVDF膜進行抗原封閉1 h。倒掉封閉液，加入TBS-T稀釋的一抗（均以1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色。采用Image J軟件測量每個條帶的IOD值，計算各蛋白質(zhì)相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 XTT細胞增殖檢測 將3組U251細胞稀釋至1×106/mL，分別向96孔板中加入2000個細胞/孔。每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細胞貼壁，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，分別在每孔加入50 μl XTT溶液，用鋁箔包裹培養(yǎng)板，于37℃溫育4 h。每孔加150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，溶解殘留的甲臜結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測波長在450 nm吸收值并繪制細胞增殖曲線。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集對數(shù)生長期的各組U251細胞，每管加入1 ml預(yù)冷的75%的乙醇溶液固定，置于4℃，固定過夜。次日，2000rpm，4℃離心5 min，收集細胞，棄上清。加入1 ml冰預(yù)冷的D-PBS重懸細胞，洗2遍，收集細胞，棄上清。每管加入500 μl的PI染色液，加入RNase A至終濃度0.5 mg/ml，輕輕渦旋重懸細胞，室溫避光孵育30 min后進行流式細胞儀檢測。利用Novo Express軟件分析熒光強度直方圖，統(tǒng)計不同處理下各時相細胞所占的比例，分析細胞周期G0/G1、S、G2/M不同時相分布情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 細胞劃痕實驗 在6孔板底部每個孔上畫5條平行直線。重懸3組細胞，分別接種2.5×105/孔于6孔板內(nèi)，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待其匯合度達90%～95%。用PBS洗滌細胞3次，再用10 μl的槍頭劃1條垂線，加入無血清的培養(yǎng)基置于5%CO2，37℃恒溫箱內(nèi)孵育。最后分別于0、12和24 h時倒置顯微鏡（100×）下采相，采用Image J軟件計算圖片上劃痕距離，計算公式如下：遷移率（%）=（0 h所測距離－預(yù)定時間所測距離）/0 h所測距離×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell細胞遷移試驗 收集對數(shù)生長期3組細胞，調(diào)整細胞密度為2.5×105/ml。選用孔徑0.8 μm Transwell小室置于24孔板中，分別向小室中加入1×105個細胞和200 μl無血清培養(yǎng)基。下室（24孔板）中各加入600 μl完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉小室內(nèi)的細胞，4%多聚甲醛固定15 min后，再用0.1%結(jié)晶紫染色，PBS漂洗1～3次，至背景呈白色。最后在顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)，隨機選取5個固定視野（×100）拍照，并評價各組細胞遷移能力。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件和Graphpad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖，計量值以（±s）表示，兩組均值間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組均值間的比較采用單因素方差分析。取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的熒光顯微鏡觀察 將空白對照組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的U251細胞在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的U251細胞可以看到清晰明亮的綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)存在EGFP蛋白的表達，而空白對照組觀察不到任何綠色熒光信號（圖1）。初步的觀察結(jié)果表明，已經(jīng)成功的構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的U251細胞株。

2.2 過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株中MTERF3蛋白的表達檢測為進一步驗證MTERF3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U251細胞株，使用兔抗MTERF3多克隆抗體對各組細胞進行Western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的陰性對照組細胞中MTERF3蛋白的表達量無明顯變化（P>0.05）。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEX-MTERF3-Flag的U251細胞中MTERF3蛋白的表達比對照組未轉(zhuǎn)染細胞高4.6倍左右，且組間差異極其顯著 （P<0.01），說明MTERF3穩(wěn)轉(zhuǎn)的U251細胞株中，外源MTERF3蛋白能夠持續(xù)的表達。見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察U251細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達情況（×100）

圖2 Western blot檢測MTERF3蛋白在各組U251細胞中的表達

2.3 MTERF3過表達對線粒體DNA拷貝量的影響 以核內(nèi)18S rDNA基因的水平作為內(nèi)參，以線粒體D-loop擴增產(chǎn)物與18S rDNA擴增產(chǎn)物的比值表示線粒體DNA與核DNA含量的相對比例，分析不同處理的U251細胞中線粒體DNA拷貝量的變化。結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組相比，U251細胞線粒體DNA拷貝量沒有顯著性差異（P>0.05），而過表達MTERF3基因能夠顯著抑制線粒體DNA的復(fù)制，導(dǎo)致線粒體DNA拷貝量下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 半定量PCR檢測MTERF3對線粒體DNA復(fù)制水平的影響

2.4 MTERF3過表達對線粒體編碼蛋白質(zhì)表達水平的影響 以線粒體蛋白質(zhì)VDAC1作為內(nèi)參，Western blot檢測MTERF3過表達對線粒體編碼蛋白質(zhì)表達水平的影響。結(jié)果表明，空白對照組和陰性對照組相比，U251細胞線粒體編碼的ND1、ND6和CYTB蛋白表達水平?jīng)]有明顯差異 （P>0.05）；實驗組細胞過表達MTERF3后，導(dǎo)致重鏈編碼的ND1、CYTB蛋白和輕鏈編碼的ND6蛋白表達水平均出現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。見圖4。

圖4 Western blot檢測MTERF3對線粒體編碼蛋白質(zhì)表達水平的影響

2.5 MTERF3過表達對U251細胞增殖的影響與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組U251細胞的增殖力在48 h、72 h和96 h時顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而空白對照組和陰性對照組的細胞增殖力未見明顯變化（P>0.05）。結(jié)果表明，MTERF3基因過表達后能夠顯著促進U251細胞的增殖。見圖5。

圖5 XTT檢測MTERF3過表達對U251細胞增殖的影響

2.6 MTERF3過表達對U251細胞周期的影響與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組細胞G0/G1期細胞百分比顯著減少，S期細胞百分比顯著增加，均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。此外，3組細胞處于G2/M期的細胞百分比無統(tǒng)計學(xué)差異 （P>0.05）。結(jié)果表明，上調(diào)MTERF3基因表達后，能促進U251細胞通過G1/S控制點進而促進細胞增殖，且未出現(xiàn)細胞周期阻滯和細胞凋亡。見圖6。

2.7 MTERF3過表達對U251細胞遷移能力的影響 在細胞劃痕實驗中，實驗組的劃痕愈合率［（68.22±8.53）%］ 顯著高于空白對照物 ［（42.45±5.43）%］和陰性對照組［（41.32±5.65）%］。 同時，在Transwell小室檢測細胞遷移的實驗中，MTERF3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實驗組在每個視野下遷移的細胞數(shù)［（435.00±42.26）個］顯著多于空白對照組［（259.00±30.22）個］和陰性對照組［（252.00±27.58）個］，組間差異非常顯著（P<0.01）。而陰性對照組和空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖7。

圖6 流式細胞術(shù)檢測過表達MTERF3對U251細胞周期的影響

圖7 Transwell檢測穩(wěn)定過表達MTERF3對U251細胞遷移能力的影響（×100）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是目前人類腫瘤中最為常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，起源于腦組織的神經(jīng)外胚層細胞，是生存時間最短及預(yù)后最差的疾病類型之一［14，15］。 近年來，手術(shù)治療、放療及化療等常規(guī)治療手段取得了較大的進步，但由于腦膠質(zhì)瘤浸潤生長的特性，導(dǎo)致腫瘤部位難以徹底切除而復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響腦膠質(zhì)瘤治療的預(yù)后［16］。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子靶向治療逐漸成為惡性腫瘤新的治療措施。研究表明，MTERF3蛋白能特異性地與線粒體DNA D-loop區(qū)的啟動子區(qū)域結(jié)合，MTERF3在mtDNA的轉(zhuǎn)錄過程中起負調(diào)控作用［11］。由于MTERF3抑制線粒體DNA的基因表達，所以線粒體DNA所編碼的呼吸鏈復(fù)合體亞基上的蛋白合成也會受到相應(yīng)的影響，降低細胞氧化磷酸化水平［17］。Hyvarinen等用二維瓊脂糖凝膠電泳法（neutral/neutral two-dimensional agarose gel electrophoresis，N/N2D-AGE）對mtDNA復(fù)制中間體的研究發(fā)現(xiàn)，在人胚腎293T細胞中過表達MTERF3，抑制線粒體DNA復(fù)制過程，導(dǎo)致細胞內(nèi)線粒體DNA拷貝量下降［18］。此外，MTERF3不僅負調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，還可以影響線粒體核糖體的合成［19］。MTERF3基因的表達異常，可能與線粒體心肌病、線粒體糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、線粒體腦病、惡性腫瘤等人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)［17，20-22］。

該研究在分析了MTERF3過表達對U251細胞線粒體基因表達水平的影響后，進一步采用XTT檢測細胞增殖，采用流式細胞術(shù)分析細胞周期。XTT結(jié)果顯示，過表達MTERF3基因能夠顯著促進U251細胞的增殖。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達MTERF3基因的U251細胞G0/G1期細胞減少，S期細胞增多，促進U251細胞從G0/G1進入S期，進而促進U251細胞增殖，并且不會導(dǎo)致細胞周期阻滯和細胞凋亡。此外，細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗均表明，MTERF3穩(wěn)定過表達能顯著提高腦膠質(zhì)瘤U251細胞的體外遷移能力。

綜上所述，該研究提示MTERF3基因過表達能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞線粒體基因表達，并促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移。本研究為進一步探討MTERF3對腦膠質(zhì)瘤細胞中線粒體氧化磷酸化活性及惡性生物學(xué)行為的影響及其分子機制提供了實驗基礎(chǔ)。