吳興富，焦芳嬋，陳學(xué)軍，張誼寒，肖炳光，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明，650021

基因型是煙葉品質(zhì)形成和風(fēng)格彰顯的載體?；瘜W(xué)成分是煙葉品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，煙葉中化學(xué)成分種類繁多（煙草中已鑒定出的成分約有5700種）[1]，各種成分含量的相互關(guān)系復(fù)雜[2]。聚類分析是數(shù)理統(tǒng)計中研究“物以類聚”的一種方法，聚在同一類的個體有較大的相似性，聚在不同類的個體差異較大[3]。聚類分析已廣泛用于通過多性狀（多指標(biāo)）評價作物[4-6]、水果[7-9]的綜合品質(zhì)，對于科學(xué)評價基因型好壞的真實性收到了較好的效果。

我國烤煙所產(chǎn)煙葉按傳統(tǒng)香型分為清香、中間香、濃香三大類[10]。從產(chǎn)量規(guī)?？?，清香型煙葉占全國煙葉的55%[11]，主要產(chǎn)自云南、福建煙區(qū)以及四川和貴州煙區(qū)的部分區(qū)域，其中云南和福建是主產(chǎn)區(qū)。近年來，卷煙工業(yè)對清香型優(yōu)質(zhì)煙葉的需求呈增加趨勢，2011年全國卷煙消耗云南煙葉占消耗總量的39.48%，同比增加1.19%[12]。聚類分析在煙草資源分類[13-15]、煙葉常規(guī)化學(xué)成分[16-18]和揮發(fā)性香氣成分[19-20]、煙葉配打[21]、香型風(fēng)格[22]、卷煙質(zhì)量穩(wěn)定性[23]等方面已有報道，但有關(guān)清香型產(chǎn)區(qū)烤煙基因型主要化學(xué)成分含量及感官評價的聚類分析未見報道。為此，本研究對清香型煙葉主產(chǎn)區(qū)云南和福建種植的11個烤煙基因型的常規(guī)化學(xué)成分、多酚物質(zhì)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量及感官評價得分進(jìn)行聚類分析，以期了解清香型產(chǎn)區(qū)不同基因型煙葉主要化學(xué)成分及感官質(zhì)量的相似性和差異，為清香型產(chǎn)區(qū)基因型選擇供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及品種

2014年，在清香型煙葉主產(chǎn)區(qū)云南和福建8個試點種植11個烤煙基因型。8個試點分別為云南華寧大興寨和大村、寧洱勐先和平村曼片組和旱灘組、宣威熱水，福建永定湖雷、陳東和建陽莒口，11個參試基因型為K326（G1）、云煙87（G2）、云煙97（G3）、云煙105（G4）、云煙110（G5）、云煙116（G6）、云煙117（G7）、云煙119（G8）、云煙207（G9）、NC71（G10）、PVH1452（G11）。

1.2 試驗設(shè)計與方法

各試點采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個基因型1個處理，3次重復(fù)共33個小區(qū)，小區(qū)栽煙70株。各試點參試基因型施氮量及氮磷鉀配比相同，種植密度、栽培調(diào)制技術(shù)及田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)操作。各小區(qū)煙株現(xiàn)蕾打頂，掛牌標(biāo)記煙株從下往上8～12葉位煙葉。采烤結(jié)束后，每個小區(qū)取8～12葉位初烤煙C3F樣品1.0 kg。

1.3 樣品檢測與感官質(zhì)量評價

各試點小區(qū)煙葉樣品按基因型混合后為兩部分，一部分由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院分析測試中心按照YC/T159—2002檢測總糖和還原糖含量，按照YC/T161—2002、YC/T160—2002、YC/T217—2007、YC/T162—2011分別檢測總氮、煙堿、鉀、氯含量，按照YC/T202—2006檢測多酚類化合物，采用水蒸汽-二氯甲烷同時蒸餾萃取、GC/MS—內(nèi)標(biāo)定量方法[24]檢測47種揮發(fā)香氣物質(zhì)含量，并按官能團(tuán)分類統(tǒng)計各類物質(zhì)含量。另一部分由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司按照Q/YNZY.J07.030—2015[25]進(jìn)行感官評吸鑒定，評價指標(biāo)包括清香型風(fēng)格（5分）（4.5～5.0典型，4.0～4.5較典型，3.0～4.0明顯，2.0～3.0較明顯，1.0～2.0尚明顯，0～1.0不明顯）和感官質(zhì)量指標(biāo)煙草香韻（10分）、香氣量（15分）、香氣質(zhì)（15分）、煙氣濃度（10分）、刺激性（15分）、勁頭（5分）、雜氣（10分）和口腔干凈度（10分）、濕潤感（5分）、回味（5分），并統(tǒng)計各指標(biāo)評吸得分及感官質(zhì)量總分（100分）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用Excel統(tǒng)計各參試基因型在8個試點的常規(guī)化學(xué)成分、多酚物質(zhì)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量及感官評價指標(biāo)得分平均值，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（v10.15）[26]進(jìn)行聚類分析。先分別對上述單類別指標(biāo)進(jìn)行聚類，然后對所有指標(biāo)進(jìn)行綜合聚類。聚類時，先將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，然后在卡方距離水平上采用離差平方和法進(jìn)行系統(tǒng)聚類。同時，根據(jù)聚類結(jié)果，采用單因素完全隨機統(tǒng)計分析方法對不同類群間或類群內(nèi)基因型間的聚類指標(biāo)及二級統(tǒng)計指標(biāo)均值（糖堿比、氮堿比、鉀氯比、多酚總量、各類揮發(fā)性香氣物質(zhì)合計量及總量、感官質(zhì)量總分）進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)化學(xué)成分含量聚類

6常規(guī)化學(xué)成分含量聚類表明，在類間距離（D2）=1.44處，11個基因型可聚為3個類群（見圖1A），K326、PVH1452、NC71為Ⅰ類，云煙87、云煙105、云煙116、云煙117為Ⅱ類，云煙97、云煙119、云煙207、云煙110為Ⅲ類。類群間鉀含量和氮堿比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他5種常規(guī)成分含量及糖堿比、鉀氯比的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。由表1可見，Ⅰ類群糖（總糖、還原糖）含量低，氯含量居中，總氮和煙堿含量高，糖堿比和鉀氯比小。Ⅱ類群糖含量高，總氮、煙堿、氯含量低，糖堿比和鉀氯比大。Ⅲ類群糖和氯含量高，總氮、煙堿含量低，糖堿比和鉀氯比居中。從基因型來源看，聚為Ⅰ類群的3個基因型為國外引進(jìn)，聚為Ⅱ類群和Ⅲ類群的基因型均為國內(nèi)選育。

表1 不同類群常規(guī)化學(xué)成分含量Tab.1 The contents of routine chemical components of different groups

2.2 多酚類物質(zhì)含量聚類

6種多酚物質(zhì)含量聚類表明，在類間距離（D2）=1.24處，11個基因型可聚為3個類群（見圖1B），云煙116、云煙87、K326為Ⅰ類，云煙97、云煙117、云煙207為Ⅱ類，云煙105、NC71、云煙110、云煙119、PVH1452為Ⅲ類。類群間蕓香苷和莨菪亭含量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他4種多酚物質(zhì)含量及多酚總量的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。由表2可見，Ⅰ類群多酚含量低，Ⅱ類群居中，Ⅲ類群多酚含量高。6種多酚物質(zhì)中，蕓香苷和綠原酸含量明顯高于其他4種，其中綠原酸含量在3個類群間差異顯著，對不同類群基因型多酚含量差異的影響較大。

表2 不同類群多酚質(zhì)含量Tab.2 Polyphenol content of different groups mg/g

2.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量聚類

47種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量聚類表明，在類間距離（D2）=3.60處，11個基因型可聚為3個類群（見圖1C），K326、NC71、PVH1452、云煙207、云煙97、云煙117為Ⅰ類，云煙87、云煙116為Ⅱ類，云煙105、云煙110、云煙119為Ⅲ類。類群間2-環(huán)戊烯-1,4-二酮等21種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量及酮類、醇類物質(zhì)含量和香氣物質(zhì)總量的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。從官能團(tuán)分類統(tǒng)計的各類物質(zhì)含量看，醇類物質(zhì)和新植二烯含量明顯高于酮類、醛類、酯類和雜環(huán)類物質(zhì)，Ⅰ類群酮類物質(zhì)含量高，醇類物質(zhì)含量和揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量居中，Ⅱ類群醇類和酮類物質(zhì)含量高，揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量高，Ⅲ類群醇類、酮類物質(zhì)含量及揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量低。醇類物質(zhì)寸拜醇、西柏三烯二醇a、西柏三烯二醇b含量在3個類群間差異顯著，對不同類群基因型揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量差異的影響較大。

表3 不同類群47種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量Tab.3 Contents of 47 kinds of volatile aroma components among different groups μg/g

2.4 感官評價得分聚類

清香型風(fēng)格及10個感官質(zhì)量指標(biāo)評價得分聚類表明，在類間距離（D2）=1.82處，11個基因型可聚為3個類群（見圖1D），K326、云煙87、云煙116為Ⅰ類，云煙105、云煙207、NC71、PVH1452為Ⅱ類，云煙97、云煙110、云煙119、云煙117為Ⅲ類。類群間勁頭得分差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他10個指標(biāo)及評吸總分的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。由表4可見，Ⅰ類群清香型風(fēng)格得分及評吸總分高于Ⅱ類群、Ⅲ類群，清香型風(fēng)格較典型，感官質(zhì)量好。Ⅱ類群評吸總分高于Ⅲ類群，清香型風(fēng)格得分有高于Ⅲ類群的傾向，清香型風(fēng)格明顯，感官質(zhì)量中等。Ⅲ類群清香型風(fēng)格明顯，感官質(zhì)量較差。同時，香氣量、香氣質(zhì)以及口腔干凈度和濕潤感得分在3個類群間差異顯著，對不同類群基因型感官質(zhì)量差異的影響較大。

表4 不同類群及Ⅰ類群內(nèi)基因型間感官評價指標(biāo)得分Tab.4 Scores of sensory evaluation indexes of genotypes among different groups and within group I

2.5 所有指標(biāo)綜合聚類

6種常規(guī)化學(xué)成分、6種多酚物質(zhì)、47種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量及11個感官評價指標(biāo)得分綜合聚類表明，在類間距離（D2）=4.75處，11個基因型可聚為3個類群（見圖1E），K326、NC71、PVH1452為Ⅰ類，云煙97、云煙207、云煙117、云煙105、云煙110、云煙119為Ⅱ類，云煙87、云煙116為Ⅲ類。在70個聚類指標(biāo)中，34個指標(biāo)類群間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，36個指標(biāo)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（表5）。綜合表5各類別化學(xué)成分含量及感官評價得分看，Ⅰ類群清香型風(fēng)格明顯，感官質(zhì)量中等，煙堿和總氮含量高，糖含量低，糖堿比小，多酚和揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量較高。Ⅱ類群清香型風(fēng)格明顯，感官質(zhì)量較差，糖含量高，煙堿和總氮含量低，糖堿比大，多酚含量高，揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量低。Ⅲ類群清香型風(fēng)格較典型，感官質(zhì)量好，糖含量高，煙堿和總氮含量低，糖堿比大，多酚含量低，揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量高（尤其是醇類物質(zhì)）。醇類物質(zhì)含量和口腔干凈度得分在3個類群間差異顯著，對不同類群基因型揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量及感官質(zhì)量差異的影響較大。

表5 不同類群化學(xué)成分含量及感官質(zhì)量指標(biāo)評吸得分差異Tab.5 Differences in chemical component content and sensory quality evaluation score among groups

圖1 11個基因型不同類別指標(biāo)系統(tǒng)聚類圖Fig.1 Cluster diagram of 11 genotypes with different category index system

2.6 基于感官評價聚類的化學(xué)成分含量差異及其與感官質(zhì)量的相關(guān)性分析

化學(xué)成分是煙葉品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，基于感官評價聚類的類群間化學(xué)成分含量差異分析表明（表6），在59種化學(xué)成分及10個二級指標(biāo)中，綠原酸含量等11種成分及3個二級指標(biāo)多酚總量、醇類物質(zhì)含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量的在基于感官評價的類群間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他成分及二級指標(biāo)的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。從表4和表6結(jié)果看，Ⅰ類群感官質(zhì)量好，綠原酸含量和多酚總量低，茄酮、降茄二酮、正己醛、2-異丙基-5氧-己醛、5-甲基糠醇、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b、c、d）含量及醇類物質(zhì)含量和揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量高。Ⅲ類群感官質(zhì)量較差，綠原酸含量和多酚總量高，5-甲基糠醇含量居中，其他9種成分的含量及醇類物質(zhì)含量和揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量低。Ⅱ類群感官質(zhì)量中等，5-甲基糠醇含量低，其他10種成分的含量及多酚總量、醇類物質(zhì)含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量均介于Ⅰ類群和Ⅲ類群之間。

表6 基于感官評價聚類的類群間化學(xué)成分含量差異Tab.6 Difference in chemical component content among groups based on sensory evaluation clustering

表7 化學(xué)成分含量與感官質(zhì)量總分的相關(guān)系數(shù)Tab.7 Correlation coefficient between chemical component content and sensory quality score

為進(jìn)一步了解化學(xué)成分與感官質(zhì)量的關(guān)系，對11個基因型49種化學(xué)成分含量及10個二級指標(biāo)與感官質(zhì)量總分進(jìn)行相關(guān)性分析（表7），結(jié)果表明，綠原酸含量等11種成分及3個二級指標(biāo)多酚總量、醇類物質(zhì)含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量與感官質(zhì)量總分的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，其他成分及二級指標(biāo)的相關(guān)性不具有統(tǒng)計學(xué)意義。即莨菪亭、茄酮、降茄二酮、正己醛、2-異丙基-5氧-己醛、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b、c、d）含量及醇類物質(zhì)含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量與感官質(zhì)量顯著或極顯著正相關(guān)，綠原酸含量、多酚總量與感官質(zhì)量顯著負(fù)相關(guān)?？梢?，綠原酸、茄酮、降茄二酮、正己醛、2-異丙基-5氧-己醛、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b）含量對清香型煙葉感官質(zhì)量影響較大。

3 討論

本研究利用系統(tǒng)聚類法，對清香型煙葉主產(chǎn)區(qū)云南和福建種植的11烤煙基因型6種常規(guī)化學(xué)成分、6種多酚物質(zhì)、47種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量及11個感官評價指標(biāo)得分先進(jìn)行單類別指標(biāo)聚類，在此基礎(chǔ)上，對上述4類共70個指標(biāo)進(jìn)行綜合聚類。從單類別指標(biāo)聚類和所有指標(biāo)綜合聚類結(jié)果看（表8），云煙116與云煙87常規(guī)化學(xué)成分、多酚物質(zhì)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、感官評價得分、所有指標(biāo)綜合均分別聚在相同類群，NC71與PVH1452、云煙110與云煙119的上述指標(biāo)亦分別聚在相同類群，其他基因型間單類別指標(biāo)聚類和所有指標(biāo)綜合聚類的差異較大，如K326、NC71、PVH1452常規(guī)化學(xué)成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、所有指標(biāo)綜合均聚為Ⅰ類，K326多酚物質(zhì)含量聚為Ⅰ類、PVH1452和NC71聚為Ⅲ類，K326感官評價得分聚為Ⅰ類、PVH1452和NC71聚為Ⅱ類。同理，其他基因型間單類別指標(biāo)聚類和所有指標(biāo)綜合聚類的差異性分析依此類推。導(dǎo)致單類別指標(biāo)聚類和所有指標(biāo)綜合聚類結(jié)果差異的原因主要有兩方面，一是參試基因型本身不同類別指標(biāo)間存在差異，二是所有指標(biāo)綜合聚類時，有些指標(biāo)的差異會被另一些指標(biāo)的差異所掩蓋，造成類群間差別模糊[27]。但對基因型性狀特點而言，任何性狀指標(biāo)的聚類結(jié)果都反映了基因型間該性狀的相似性和差異[28]。因此，本研究11個基因型單類別指標(biāo)常規(guī)化學(xué)成分、多酚物質(zhì)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、感官評價以及所有指標(biāo)綜合聚類的相似性或差異，可為基因型性狀特點或育種利用研究提供參考。

表8 單類別指標(biāo)和所有指標(biāo)綜合聚類差異Tab.8 Differences in single index and full-indexes comprehensive clustering

化學(xué)成分是煙葉品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而感官評價仍是目前判斷煙葉品質(zhì)好環(huán)的最終手段[22]。本研究11個基因型感官評價可聚為3個類群，Ⅰ類群感官質(zhì)量好、Ⅱ類群中等、Ⅲ類群較差，基于感官評價聚類的化學(xué)成分含量差異及其與感官質(zhì)量相關(guān)性的分析表明，茄酮、降茄二酮、正己醛、2-異丙基-5氧-己醛、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b、c、d）含量及醇類物質(zhì)含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量與感官質(zhì)量顯著或極顯著正相關(guān)，綠原酸含量和多酚總量與感官質(zhì)量顯著負(fù)相關(guān)，且這些指標(biāo)在基于感官評價聚類的類群間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，在一定范圍內(nèi)，調(diào)控綠原酸含量，提高茄酮、降茄二酮、正己醛、2-異丙基-5氧-己醛、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b、c、d）含量有利于彰顯清香型煙葉的感官質(zhì)量。同時，莨菪亭含量與感官質(zhì)量顯著正相關(guān)，但在基于感官評價的類群間差異不顯著，其原因與多指標(biāo)綜合聚類時，一些指標(biāo)的差異會被另一些指標(biāo)的差異所掩蓋有關(guān)，造成類群間差別模糊[27]。5-甲基糠醇含量與感官質(zhì)量的相關(guān)性不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但在基于感官評價的類群間差異顯著，其原因可能與煙葉中各種成分含量的相互關(guān)系復(fù)雜[2]有關(guān)，這種關(guān)系不僅是含量或占比關(guān)系，可能包括更為復(fù)雜的多成分含量占比組合關(guān)系等，這亦是目前煙葉化學(xué)物質(zhì)含量對感官質(zhì)量影響尚未取得一致認(rèn)識的原因所在[29]。

本研究云煙116是2016年通過全國審定的烤煙基因型，該基因型感官評價得分與主栽基因型云煙87和K326[30]聚為同一類（圖1D），這3個基因型清香型風(fēng)格較典型，感官質(zhì)量好，相似性較高，可為清香型產(chǎn)區(qū)彰顯煙葉品質(zhì)和風(fēng)格的基因型選擇提供參考。同時，近年來，主栽基因型云煙87種植比例過高的現(xiàn)象突出，2016年種植比例44.93%，2017年49.56%[30]，本研究云煙116與云煙87常規(guī)化學(xué)成分、多酚類物質(zhì)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、感官質(zhì)量等單類別指標(biāo)及所有指標(biāo)綜合的相似性均較高，這為云煙87種植比例偏高區(qū)域搭配種植云煙116提供了依據(jù)。但從感官評價得分聚為Ⅰ類群的3個基因型（表4）看，云煙116香氣量和煙氣濃度得分低于K326，有低于云煙87的傾向。因此，在選擇種植云煙116時，需結(jié)合當(dāng)?shù)厣a(chǎn)實際，開展提高該基因型香氣量和煙氣濃度的配套技術(shù)研究，通過良種良法配套，充分挖掘云煙116彰顯煙葉品質(zhì)和風(fēng)格的潛力。

目前，國內(nèi)煙葉香型風(fēng)格在傳統(tǒng)香型[10]基礎(chǔ)上劃分為8種類型[31]，其中，本研究試點所涉及的云南產(chǎn)區(qū)煙葉為清甜香型，其主要特征為清甜香突出、青香明顯，福建產(chǎn)區(qū)煙葉為清甜蜜甜香型，其主要特征為清甜香突出、蜜甜香明顯、花香微顯，新分類法中云南和福建煙葉清甜香突出的主體特征，與傳統(tǒng)清香型煙葉清甜香韻突出的特征[32]一致，但新分類法對明確這2種香型煙葉主要風(fēng)格特征差異的描述更清晰。同時，本文研究重點是分析傳統(tǒng)清香型產(chǎn)區(qū)11個烤煙基因型主要化學(xué)成分含量及感官質(zhì)量的相似性和差異，未涉及云南和福建煙葉風(fēng)格特征差異的分析。因此，本文研究結(jié)果在新分類法中仍具有參考借鑒價值，但有關(guān)清香型風(fēng)格的描述在新分類法中存在一定局限性。

4 結(jié)論

（1）云煙116與云煙87、NC71與PVH1452、云煙110與云煙119的各類別指標(biāo)及所有指標(biāo)聚類均分別聚在相同類群，化學(xué)成分、感官質(zhì)量及所有指標(biāo)的相似性均較高，其他基因型間單類別指標(biāo)聚類和所有指標(biāo)綜合聚類的結(jié)果差異較大。

（2）莨菪亭、茄酮、降茄二酮、正己醛、2-異丙基-5氧-己醛、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b、c、d）含量及醇類物質(zhì)含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量與感官質(zhì)量顯著或極顯著正相關(guān)，綠原酸含量和多酚總量與感官質(zhì)量顯著負(fù)相關(guān)，除莨菪亭外，這13個指標(biāo)在基于感官評價聚類的類群間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

（3）感官評價聚為Ⅰ類群的云煙116、云煙87、K326清香型風(fēng)格較典型，感官質(zhì)量好，感官質(zhì)量及多酚類物質(zhì)含量相似性較高，云煙116與云煙87感官質(zhì)量及化學(xué)成分的相似性較高，可為清香型產(chǎn)區(qū)基因型選擇提供依據(jù)。