楊飛，李中皓，嚴(yán)俊，王穎，劉珊珊，鄧惠敏，邊照陽，范子彥，唐綱嶺*

1 國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001；

2 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西南寧北湖南路28號(hào) 530001

電子煙是近幾年來興起的一種新型煙草制品，又稱電霧化卷煙，電子煙主要由電池桿（包括發(fā)光二極管、電池、氣動(dòng)開關(guān)、控制電路、霧化器等元器件）和煙彈（包括貯液腔和吸嘴） 組成[1]。電子煙通過芯片和氣流感應(yīng)器控制煙霧輸出量及工作狀態(tài)，加熱后，將含有煙堿和香精的溶液霧化成微粒。其中煙彈中的煙液是核心，主要成分是含煙堿的丙二醇、甘油或聚乙二醇等[2-3]。同時(shí)，為了滿足不同吸煙者對(duì)電子煙產(chǎn)品口感與風(fēng)味多樣化的需求，會(huì)添加各種香精。煙液中香味成分的含量很低，卻是決定電子煙感官品質(zhì)最重要的因素之一[4-5]。

甜味劑是一類可以提升食品甜味和口感的添加劑，具有甜度高、熱量低、價(jià)格低廉、不易發(fā)生齲齒等優(yōu)點(diǎn)，在食品生產(chǎn)中應(yīng)用極其廣泛。GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了允許使用的食品添加劑，其中安賽蜜、糖精、甜蜜素、紐甜和阿斯巴甜等5種屬于最常用的人工合成食品甜味劑[6]，其化學(xué)名稱和使用限量見表1。合理使用人工合成食品甜味劑是安全的，不會(huì)對(duì)食用者的健康產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。但如果超限量、超范圍，或者使用劣質(zhì)的人工合成食品甜味劑，則會(huì)對(duì)消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生一定的負(fù)面影響[7-9]。因此研究電子煙煙液中多種人工合成甜味劑不僅是技術(shù)發(fā)展的需求，也是實(shí)際應(yīng)用的需要。

目前，對(duì)于人工合成甜味劑的測(cè)定主要集中于飲料、白酒、乳制品等。測(cè)定方法主要有離子色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、高效液相色譜法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-16]等。由于人工合成甜味劑的物理化學(xué)性質(zhì)、電化學(xué)性質(zhì)、光譜性質(zhì)的不同，液相色譜法很難滿足多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)的要求，離子色譜法和毛細(xì)管電泳法也由于靈敏度低等原因應(yīng)用不多。隨著各國(guó)對(duì)甜味劑使用要求越來越嚴(yán)格，使得開發(fā)更為簡(jiǎn)單快速、靈敏度高的檢測(cè)方法成為必要。由于液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜的選擇性強(qiáng)、靈敏度高以及抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)，目前已廣泛應(yīng)用于食品添加劑的測(cè)定[17-19]。

本研究結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析速度快，靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，同時(shí)采用分散固相萃取凈化方式，建立了電子煙煙液中多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短和靈敏度高，適合實(shí)驗(yàn)室中對(duì)甜味劑的批量檢測(cè)。

表1 5種甜味劑的化學(xué)名稱和部分限量要求Tab.1 Chemical name and partial limit requirements of 5 sweeteners

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

10種不同品牌的電子煙煙液，編號(hào)為1#～10#，其中1#～4#為煙草原味，5#～6#為薄荷味，7#～10#為水果香型，全部通過網(wǎng)絡(luò)購(gòu)買。

安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜和紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（＞98.0%，德國(guó)Augsburg公司）；甲酸、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；N-丙基乙二胺（PSA）吸附劑、石墨化炭黑吸附劑和C18吸附劑（40 μm，美國(guó)Agilent公司）；水為超純水。

Waters TQD四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀[配備電噴霧電離源（ESI）]、Waters Acquity I Class超高效液相色譜 儀、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm, 1.7μm）（美國(guó)Waters公司）；VX200渦旋振蕩儀（美國(guó)Labnet公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；AEl63電子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取0.2 g電子煙煙液（精確至0.01 g），并置于5.0 mL容量瓶中。用超純水稀釋至刻度，搖勻；移取1.5 mL溶液至2.0 mL離心管中，并加入 25 mg C18吸附劑，渦旋振蕩2 min，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾。濾液進(jìn)UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取10 mg 5種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品，于同一個(gè)100 mL容量瓶中用超純水定容，制得5種甜味劑質(zhì)量濃度為1 00 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液25、50、100、200、500 μL至5個(gè)10 mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容，制得不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中5種甜味劑質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 μg mL-1。

1.2.3 檢測(cè)條件[19]

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～2 min為5% A，2～6 min為5% A～30% A，6～12 min為30% A～90% A，12～13 min為90% A；13～13.5 min為90% A～5% A；13.5～15 min為5% A；質(zhì)譜掃描方式：負(fù)離子掃描；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；錐空氣流量：50 L/h；停留時(shí)間：100 ms；毛細(xì)管電壓：2.8 KV；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集采用MassLynxV4.1軟件。平均值、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算采用Microsoft Excel 2007 版軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

圖1 5種甜味劑的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 5 sweeteners

分別考察水-甲醇、水-乙腈體系及其甲酸對(duì)5種甜味劑的分離影響。結(jié)果表明，甲醇和乙腈對(duì)5種甜味劑的分離效果相近，在不添加酸的情況下，5種甜味劑的峰形不對(duì)稱，存在明顯拖尾情況，考慮到乙腈的毒性較甲醇大，因此選用甲醇-水作為流動(dòng)相，并在水溶液中加入甲酸。結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸后5種甜味劑的的信號(hào)明顯降低，但是色譜峰形得到明顯改善。推測(cè)其原因是：糖精鈉又稱鄰苯甲?；酋啺封c，甜蜜素其化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，安賽蜜又稱為乙酰磺胺酸鉀，阿斯巴甜和紐甜為氨基酸的酯類，這些化合物均呈堿性，容易與C18柱殘留硅醇基發(fā)生吸附作用而導(dǎo)致峰拖尾，采用弱酸性流動(dòng)相可以改善拖尾現(xiàn)象。因此選擇甲醇-水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相。采用優(yōu)化后的色譜條件對(duì)5種甜味劑進(jìn)行分析，其選擇離子色譜圖如圖1所示，可以看出，5種甜味劑的分離效果較好。

2.1.2 質(zhì)譜條件的確定

取10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蠕動(dòng)注射進(jìn)樣方式在ESI+和ESI—模式下進(jìn)行全掃描。結(jié)果顯示，5種甜味劑在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值均高于正離子模式，因此選擇負(fù)離子掃描。在負(fù)離子（ESI—）模式下，阿斯巴甜和紐甜[M-H]—，甜蜜素[M-Na]—, 糖精鈉[M-Na-2H2O]—，安賽蜜[M-K]—豐度較高，因此將其選擇為母離子。以母離子為前體離子，進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，選取豐度較強(qiáng)、信號(hào)穩(wěn)定的碎片離子作為定性和定量子離子。其中甜蜜素的母離子m/z 178.0裂解時(shí)只得到m/z 80.1一個(gè)碎片離子，因此選擇178.0作為定性子離子。最后，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣流量、錐孔氣流量、離子源溫度、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)條件，使各個(gè)離子對(duì)的響應(yīng)最高。優(yōu)化得到的5種甜味劑在負(fù)離子模式下的的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

2.1.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于不同廠家的煙液樣品中乙醇、丙三醇等醇類的含量不同，在進(jìn)行液相色譜分離時(shí)這些醇類會(huì)對(duì)甜味劑在色譜柱中的保留性能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致被分析物在色譜柱上的保留作用減弱，使峰位前移，保留時(shí)間不穩(wěn)定。為了消除煙液中醇類物質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響，且這5種甜味劑均易溶于水，所以直接用水對(duì)樣品稀釋后進(jìn)行檢測(cè)即可。稀釋的方法不僅可以降低醇類對(duì)色譜峰形影響，而且可以降低基質(zhì)效應(yīng)，但是同時(shí)也會(huì)降低方法的檢出限。經(jīng)過不同稀釋體積對(duì)比，最終確定稀釋體積5 mL。同時(shí)為了進(jìn)一步降低基質(zhì)干擾，減少樣品中的雜質(zhì)對(duì)儀器的污染，分別采用25 mg常用的分散固相萃取材料（PSA、C18和石墨化炭黑）對(duì)稀釋后的樣品進(jìn)行分散固相萃取凈化。結(jié)果（表3）顯示：C18效果最好，各甜味劑的回收率在92.6%～102.2%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.0%，可以滿足定量的要求；石墨化炭黑效果最差，其對(duì)所有甜味劑均有不同程度的吸附，導(dǎo)致回收率偏低。

表2 5種甜味劑的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters of 5 sweeteners

表3 分散固相萃取試劑對(duì)5種甜味劑回收率的影響（n=5）Tab.3 Effect of dispersive solid phase extraction reagent on recoveries of 5 sweeteners

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以5種甜味劑定量離子對(duì)的色譜峰面積（Y）（CPs）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中5種甜味劑的濃度（X） （μg/mL）為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線形式為Y = AX + B，其中A和B分別表示為斜率和截距。以各種甜味劑信噪比（S/N）為3時(shí)的進(jìn)樣濃度確定為每種甜味劑的LOD。以各種甜味劑信噪比（S/N）為10時(shí)的進(jìn)樣濃度確定為每種甜味劑的LOQ。結(jié)果（表4）顯示，各甜味劑在0.25～5 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.998，可以滿足定量分析要求。

表4 5種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.4 Standard working curve, correlation coefficients, LODs and LOQs of 5 sweeteners

2.2.2 方法的回收率及精密度

通過加標(biāo)樣品的回收率實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該方法的重復(fù)性，并以RSD來評(píng)價(jià)精密度。在不同濃度水平（LOQ，10倍LOQ，20倍LOQ）的加標(biāo)樣品上進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算樣品中各種甜味劑的回收率和RSD。結(jié)果（表5）顯示，回收率在92.5%～105.2%，且RSD均小于5.0%。

2.2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)市售的10款電子煙煙液樣品進(jìn)行了5次平行測(cè)定，結(jié)果（表6）顯示：2個(gè)樣品中檢出有紐甜，含量分別為3.35和4.52 mg·kg-1；1個(gè)樣品檢出有甜蜜素，含量為2.48 mg·kg-1，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%。圖2為5#樣品的選擇離子色譜圖。

表5 不同濃度下的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Tab.5 Recoveries and RSDs of 5 sweeteners under different concentrations (n=6)

2.2.4 方法對(duì)比

文獻(xiàn)報(bào)道方法[16]采用超純水超聲提取，定容后過濾進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。采用本方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法對(duì)1#和8#樣品進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)比分析，結(jié)果（表7）顯示，本方法檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道方法檢測(cè)結(jié)果之間無明顯差異，說明兩種方法的一致性良好，但是本方法采用C18固相萃取凈化后，樣品更干凈，減輕了對(duì)儀器的污染。

2.2.5 方法的耐用性

耐用性也稱之為穩(wěn)健性，根據(jù)GB/T 27417-2017[20]和GB/T32465-2015[21]，一個(gè)好的分析方法應(yīng)該不受環(huán)境等一些因素的微小變化而變化。耐用性試驗(yàn)是考察環(huán)境或其他條件變量對(duì)分析方法影響的一項(xiàng)檢驗(yàn)程序。進(jìn)行耐用性試驗(yàn)的目的在于鑒別這些必須仔細(xì)控制的實(shí)驗(yàn)條件，并針對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度有較大影響的因素，提出有效控制措施。通常需要考慮影響檢測(cè)過程與結(jié)果的微小條件（因素）包括但不僅限于以下內(nèi)容：人員、儀器、實(shí)驗(yàn)材料、環(huán)境等。

表6 實(shí)際樣品的測(cè)定 Tab.6 The determination of real samples

圖2 5#樣品的選擇離子色譜圖Fig.2 SIM chromatograms of 5# sample

本文在不同試驗(yàn)條件下對(duì)1#樣品進(jìn)行了7因素2水平的考察，耐用性試驗(yàn)因素詳見表8，按照表9的測(cè)試編號(hào)組合，共做8次試驗(yàn)，結(jié)果以s、t、u、v、y、w、x、y、z表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以流速為例，當(dāng)流速由A水平變?yōu)閍水平時(shí)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的分析方法為：涉及A的所有結(jié)果的平均值涉及a的所有結(jié)果的平均值由A變?yōu)閍之后對(duì)結(jié)果的影響用來表示。比較7個(gè)因素的差值的絕對(duì)值，按從大到小排列，如果某個(gè)因素變化對(duì)結(jié)果有較大影響的話，那么該因素的差值絕對(duì)值將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他因素的差值絕對(duì)值，出現(xiàn)這種情況，應(yīng)嚴(yán)格控制相應(yīng)的檢測(cè)條件，并在有關(guān)的文件中做明確的說明。

表7 不同方法的測(cè)定結(jié)果對(duì)比Tab.7 Comparison of testing results by different methods (mg·kg-1)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表10）顯示：在7個(gè)因素中，樣品進(jìn)樣量影響排在首位，在檢測(cè)中應(yīng)當(dāng)注意這個(gè)因素，嚴(yán)格規(guī)定其檢測(cè)條件。

表8 耐用性試驗(yàn)因素Tab.8 The factors in the ruggedness test

表9 耐用性試驗(yàn)組合Tab.9 Combination of the ruggedness test

表10 耐用性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.10 The results of the ruggedness tests

3 結(jié)論

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定電子煙煙液中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜和紐甜5種人工合成甜味劑的方法。在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，5種人工合成甜味劑的回收率在92.5%～105.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%～4.5%之間。該方法以超純水作為提取溶劑，綠色環(huán)保，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，前處理過程簡(jiǎn)單快速、分析時(shí)間短，能滿足實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)需要。