葉潔梅 黃國雄 蔡志玲 伍桂雄 黃媛恒

近年來，癲癇與免疫相關(guān)的學(xué)說漸漸倍受關(guān)注，異常免疫反應(yīng)可能是癇性發(fā)作和癲癇形成的始動因素之一，小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元可作為免疫活性細(xì)胞，參與和影響炎癥反應(yīng)，TLR4是Toll樣受體家族（Toll-like receptors,TLRs）受體家族重要成員，TLR4是小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的重要炎性受體，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和免疫調(diào)控分子表達(dá)，影響癲癇的發(fā)生和進(jìn)展，具體作用尚不十分清楚[1]。本研究擬體外觀察大鼠海馬癲癇組織中細(xì)胞TLR4介導(dǎo)的炎癥因子IL-1β、IL-6和通路蛋白MyD88，進(jìn)一步闡明癲癇發(fā)病中的炎癥作用。

1 材料與方法

1.1 體外自發(fā)性癲癇樣放電海馬腦片模型制備取新生6～9 d SD鼠，用 75%乙醇浸泡消毒后，無菌條件下分離出完整的海馬，置于無菌的3%瓊脂塊凹槽中，于振動切片機(jī)的載物平臺上，4℃HBSS液中以400 μm厚度進(jìn)行切片。在 6孔培養(yǎng)板內(nèi)插入微孔濾膜，將完好的海馬腦片分放在各孔內(nèi)的濾膜上，各孔內(nèi)加1.3 mL的完全培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2、平衡濕度的條件下培養(yǎng)，每周半量更換培養(yǎng)液2次，倒置相差顯微鏡下觀察生長情況，培養(yǎng)至7 d。人工腦脊液（artificial cerebral spinal fluid,ACSF） 成分 （mmol/L）：NaCI 124、KCI 3.3、KH2PO41.2、NaHCO326、CaCL22.5、MgSO42.4、葡萄糖10，PH 7.4。腦片在ACSF中通95%O2及5%CO2孵育至少1 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)改用未加Mg2+ACSF（即無Mg2+ACSF）灌流 3 h，制備自發(fā)性癲癇樣放電海馬腦片模型，于造模前和造模后1 d、3 d、7 d各時(shí)點(diǎn)收集樣品進(jìn)行檢測。

1.2 qRT-PCR檢測 于造模前和造模后1 d、3 d、7 d各個時(shí)間點(diǎn)收取組織標(biāo)本，冰上碾磨，提取海馬組織總RNA（Invitrogen公司），電泳及紫外分光光度計(jì)鑒定純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（Promega公司）。用SYBR Green熒光染料 （Bio-Rad公司），根據(jù)試劑盒說明書完成40個PCR循環(huán)，收集熒光信號并分析結(jié)果。每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，采用公式2-△△CT計(jì)算各目的基因mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 Western blot檢測 于造模前后 1 d、3 d、7 d各時(shí)點(diǎn)，用蛋白提取試劑盒按操作說明提取細(xì)胞總蛋白,紫外線分光光度計(jì)測定蛋白濃度后煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)4 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入待檢測蛋白單克隆抗體（Bioss、Abbkine 公司），4℃孵育過夜,洗膜3次，加入二抗，室溫孵育 1 h，洗膜，顯色曝光，分析TLR4和信號蛋白MyD88的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，采用±s進(jìn)行描述。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多個樣本間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TLR4、MyD88、IL-1β 和 IL-6 mRNA 水平qRT-PCR結(jié)果顯示，和造模前大鼠正常海馬組織對照組相比，造模后1 d、3 d、7 d癲癇樣放電海馬腦片中各時(shí)間點(diǎn)TLR4、MyD88 mRNA的相對表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.001），同樣，炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA的相對表達(dá)水平也明顯增高（P＜0.001）（見圖 1）。

圖1 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中T L R 4、M y D 8 8、I L-1 β和I L-6m R N A水平(與正常對照組相比，***P＜0.0 0 1)

2.2 TLR4和MyD88蛋白水平 Western blot結(jié)果顯示，和造模前大鼠正常海馬組織對照組相比，造模后 1 d、3 d、7 d各個時(shí)間點(diǎn)的 TLR4、MyD88 蛋白的表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.001）（見圖 2）。

圖2 大鼠正常海馬組織和癲癇樣放電海馬腦片中T L R 4和M y D 8 8蛋白水平

3 討論

近年來，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)表明，腦部炎癥反應(yīng)可能是癇性發(fā)作和癲癇形成的重要機(jī)制之一，癲癇發(fā)作后快速誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞和外周免疫細(xì)胞的活化以及局部炎性細(xì)胞因子的分泌，炎癥反應(yīng)同時(shí)也可誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，促進(jìn)海馬發(fā)生病理性改變，如神經(jīng)元損傷丟失、膠質(zhì)細(xì)胞再生、苔鮮纖維發(fā)芽等[2-4]。TLR4在腦組織中主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元。目前國內(nèi)外關(guān)于TLR4及其信號通路與癲癇關(guān)系的研究較少。MAROSO等[5]發(fā)現(xiàn)在海人藻酸致癇小鼠急性期和慢性期海馬內(nèi) TLR4在 CA1、CA3、DG區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上表達(dá)增多，TLR4基因敲除或TLR4拮抗劑處理小鼠能對抗海人藻酸所致的癇性發(fā)作。RODGER等[6]應(yīng)用LPS對大鼠皮質(zhì)進(jìn)行研究，當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合后，誘發(fā)場電位的幅度增加3倍，并引發(fā)局部癲癇樣放電，而此效應(yīng)可以被IL-IR拮抗劑阻斷。DAS等[7]對出生后2周的大鼠注射LPS，激活TLR4，誘發(fā)輕微的炎癥反應(yīng)，當(dāng)這些大鼠成年后對海人酸、匹羅卡品或戊四氮誘發(fā)癲癇的易感性增加。本實(shí)驗(yàn)研究觀察到體外新生SD大鼠海馬神經(jīng)元無鎂細(xì)胞外液所致難治性癲癇模型中TLR4蛋白及mRNA增高，且隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，與上述研究結(jié)果相一致。

MyD88是TLR4介導(dǎo)信號通路的重要胞內(nèi)接頭蛋白，具有負(fù)責(zé)募集下游信號分子的 N端死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）和承接 TLRs活化信號的C端TIR結(jié)構(gòu)域。TLR4與內(nèi)源性配體如熱休克蛋白、脂 多 糖 （lipopolysaccharide，LPS）等激活后，通過TIR結(jié)構(gòu)域募集MyD88樣接頭蛋白MAL（MyD88 adaptor-like protein，MAL） 和 MyD88，與IRAK（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK） 家族蛋白分子結(jié)合成為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，后者磷酸化而脫離 MyD88/I-RAK復(fù)合體，結(jié)合并激活接頭蛋白TNF受體相關(guān)因子（TNFR-associationfactor6,TRAF6），促使NF-κB由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，激活 IL-1β、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）、補(bǔ)體、趨化因子等基因表達(dá)，最終導(dǎo)致炎癥因子釋放[8-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠癲癇樣放電海馬組織中，MyD88的mRNA和蛋白的升高，炎性因子IL-1β和IL-8 mRNA升高，表明其可能通過MyD88通路誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

鄭軍（1971-），男，山東乳山人，博士，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院教授，主要研究領(lǐng)域：農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)理論與政策。

綜上所述，本研究表明，癲癇腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面表達(dá)的TLR4可作為受體，通過MyD88通路，引起炎癥因子的分泌增多，可能是癲癇的異常免疫機(jī)制之一，免疫調(diào)節(jié)和抗炎治療可能是癲癇治療的潛在新靶點(diǎn)。