林 曉，譚睿陟，劉彤彤，張宇韋，王 麗

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000）

隨著我國(guó)生活水平不斷提高，糖尿病等慢性代謝疾病的發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重威脅到人類健康，已成為較大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2]。

db/db小鼠為美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室研發(fā)，該小鼠4號(hào)染色體的瘦素受體等位基因突變形成了自發(fā)性的糖尿病。db/db小鼠沒(méi)有繁殖能力，將雜合子db/m與db/m進(jìn)行交配，繁殖的后代有三種表型：1/4的野生型m/m，1/2的雜合子db/m,1/4的純合子db/db。db/m和m/m在體型上相似，它們的血糖、體重、血漿都正常。但是由于m基因?qū)Υx影響較大，所以m/m與db/m相比，代謝效率更高，更容易耐受饑餓。而db/db在2周齡左右即出現(xiàn)高胰島素血癥，3到4周齡明顯肥胖，4到8周齡出現(xiàn)高糖血癥，并表現(xiàn)出多食，消渴，多尿等典型糖尿病的臨床表現(xiàn)，其腎臟，心血管，末梢神經(jīng)等多個(gè)系統(tǒng)可觀察到病理變化，在研究糖尿病發(fā)病機(jī)制及治療方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。HRM（high resolution melting），即“高分辨率熔解曲線”，是最近在國(guó)內(nèi)外興起的最新SNP及突變研究工具，具有簡(jiǎn)單、快速、高通量、低成本的特點(diǎn)，可用于突變掃描，基因分型和甲基化研究。該技術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)qPCR試劑的基礎(chǔ)上再加入飽和雙鏈DNA結(jié)合染料即可進(jìn)行，無(wú)需序列特異性探針，直接運(yùn)行高分辨率熔解曲線，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。由于純合db/db小鼠基因型鑒定困難，常用的小鼠基因型鑒定方法酶切法和DNA測(cè)序法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本相對(duì)較高。本文采用HRM技術(shù)建立了對(duì)db/db小鼠基因型鑒定的方法，并對(duì)其結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性進(jìn)行了驗(yàn)證[4-5]，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

db/db小鼠（BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J，Jax編號(hào)：000642）購(gòu)于Jax Lab。于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)，在飼養(yǎng)期間每日給予小鼠足夠的SPF級(jí)飼料和新鮮的飲用水，室溫20～22℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照12 h明暗交替。在出生3周左右剪取鼠尾提取DNA，利用HRM技術(shù)鑒別野生型（m/m），雜合子（db/m），純合子（db/db）[6]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

2×Super EvaGreenMaster Mix for HRM試劑盒購(gòu)于US Everbright；DNA提取試劑：SDS購(gòu)于上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，Tris、EDTA購(gòu)于上海生工工程股份有限公司，蛋白酶K購(gòu)于上海艾研生物科技有限公司；酶切試劑：Taq polymerase購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，dNTP、AfaI、0.1%BSA、10×buffer購(gòu)于Takara。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

主要儀器LightCycler?480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 ，MSC-100ThermoShakerIncubator，Nano-Drop2000 Spectrophotometer，BIO-RAD PowerPac Basic電泳儀及電泳槽，Veriti?96-Well Thermal Cycler。

1.2 方法

1.2.1 模型小鼠DNA提取

酚氯仿提取法:剪取0.3～0.5 cm小鼠尾巴，放入1.5 mL EP管；加入190 μL裂解液和10 μL蛋白酶K（10 mg/mL），55℃，750 r/min過(guò)夜震蕩，使之充分消化；加入10 μL RNA酶(20 mg/mL)，混勻，37 ℃恒溫箱中放置1 h后13 000 r/min離心5 min,取上清到新的1.5 mL EP管中；加入等體積（200 μL）的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，反復(fù)顛倒 20次后室溫放置5 min；4℃下13 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層水相（約200 μL）至一新的1.5 mL EP管中；加入等體積(200 μL)異丙醇沉淀DNA,反復(fù)顛倒離心管20次，13000 r/min，15 min收集沉淀的DNA；小心傾倒出異丙醇。將DNA沉淀浸沒(méi)于1 mL 70%乙醇里。如果沉淀比較松散，再離心5 min。傾倒除去乙醇，開(kāi)蓋在室溫下放置15～20 min或在37℃孵育箱中放置5 min，讓乙醇充分揮發(fā)（此步驟重復(fù)兩次）；加入50 μL ddH2O，輕微震蕩使DNA沉淀溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

改良后的DNA提取方法:剪取小鼠尾端約0.5～1 cm，放入1.5 mL EP管中；每管加0.5 mL裂解液[0.5%SDS，0.05 M Tris-HCL(pH 8.0),2.5 mM EDTA，0.1 M Nacl]和 50μl蛋白酶 K(100 μg/mL)[7]，55 ℃震蕩過(guò)夜；第2 d將樣本，12 000 r/min，4℃，離心 10 min；收集上清加入1.5 mL EP管中，加1 mL100%乙醇，蓋緊蓋子后輕搖，可見(jiàn)絮狀沉淀；13 000 r/min，離心15 min，棄上清；加70%乙醇1 ml，洗滌，13000 r/min，離心10～15 min；棄上清，收集沉淀，室溫放置10～15 min；每管加100 μL ddH2O，蓋好后在室溫放置1 h或數(shù)小時(shí)使之充分溶解；待DNA全部溶解后-20℃保存（如DNA溶解不完全,在37℃水浴中放置30～60 min，但不可過(guò)夜）。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成：

根據(jù)Geenbank中Lepr基因序列（NC_000070），設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的引物，見(jiàn)表1、表2。

表1 用于HRM的正向和反向引物

表2 用于DNA測(cè)序的正向和反向引物

1.2.3 反應(yīng)體系及條件

PCR擴(kuò)增及HRM分型：PCR擴(kuò)增及HRM分型在LightCycler?480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成，使用包含一種專為qPCR和高分辨溶解曲線分析設(shè)計(jì)的DNA結(jié)合染料的2×Super EvaGreen Master Mix for HRM試劑盒（US Everbright Inc.），在PCR儀上運(yùn)行Gene Scanning選項(xiàng)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。最初的反應(yīng)體系：2 × Mix for HRM 10 μL；primer hrm F+R 1 μL；DNA模板（10 ng/uL），1 μL；ddH2O8 uL；優(yōu)化后的反應(yīng)體系：2× Mix for HRM 5 uL；primer hrm F+R 1.5 uL；DNA模板（5 ng/μL）1 μL；dd H2O 2.5 μL。最適反應(yīng)條件：pre-incubation，95 ℃ 2 min；amplication，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)；HRM，95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s；cooling 1 h。

測(cè)序法：PCR擴(kuò)增體系10 × buffer 2 μL；PrimerF 0.5 μL；PrimerR 0.5 μL；dNTP 1 μL；Taq polymerase 0.2 μL；ddH2O 14.8 μL；DNA 1 μL；然后在PCR儀直接運(yùn)行“Genotyping”程序（stage 1：95℃ 5 min；stage 2：95 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；stage 3：68℃ 10 min，16℃ ∞。）PCR完成后，用1%的膠點(diǎn)樣2 μL檢測(cè)是否有條帶，將有條帶的陽(yáng)性樣本送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 血糖測(cè)定

糖尿病小鼠會(huì)出現(xiàn)糖代謝紊亂，所以在小鼠空腹12 h后，抽取尾尖靜脈血測(cè)定其血糖含量，從出生后第8周齡開(kāi)始，每隔一周檢測(cè)一次，持續(xù)一個(gè)月，觀察三種基因型小鼠的血糖變化趨勢(shì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 改良DNA提取方法與常規(guī)方法的結(jié)果

對(duì)所提取的DNA測(cè)定其在260 nm和280 nm處的吸光度值，通過(guò)A260/A280的比值判定DNA的純度。檢測(cè)結(jié)果顯示，用常規(guī)方法提取的DNA其A260/A280比值多數(shù)小于1.8，提示可能存在蛋白質(zhì)污染；而改良方法提取的DNA其A260/A280比值多為1.8～2.0，純度較高，說(shuō)明改良DNA提取方法比常規(guī)方法更優(yōu)。

2.2 利用HRM技術(shù)進(jìn)行基因鑒定的三種分型結(jié)果

由于野生型，純合子，雜合子三種基因型具有不同的核酸序列，溶解曲線有所差異，據(jù)此可以分辨出三種基因型。在所設(shè)計(jì)的反應(yīng)條件下對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，能夠準(zhǔn)確區(qū)分出野生型（m/m），純合子(db/m)，雜合子(db/db)，見(jiàn)圖1。

2.3 HRM反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

圖1 利用高分辨溶解曲線（HRM)分析技術(shù)對(duì)db/db小鼠的基因分型結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了三種不同退火溫度，分別是58℃、62℃、65℃，最后的結(jié)果表明當(dāng)退火溫度為58℃時(shí)更能準(zhǔn)確地區(qū)分出三種基因型的熔解曲線。通過(guò)對(duì)退火溫度的優(yōu)化，找到最適反應(yīng)條件，提高了分型準(zhǔn)確性。當(dāng)所用DNA模板濃度和其他試劑用量減半，也能獲得良好的分型結(jié)果，在很大程度上節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

2.4HRM分型結(jié)果與DNA測(cè)序法結(jié)果一致

將用qPCR-HRM已經(jīng)分型的三種基因型樣品，再用DNA測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示HRM分型結(jié)果與DNA測(cè)序法分型結(jié)果一致，證明HRM分型結(jié)果的準(zhǔn)確性(見(jiàn)圖2）。

2.5 HRM分型結(jié)果與小鼠表型一致

圖2 db/db小鼠的DNA測(cè)序分型結(jié)果

小鼠在出生三周左右就被減尾鑒定基因型，在剪去尾后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。在出生2～3個(gè)月后，與野生型和雜合子相比，db/db小鼠多飲，多食，多尿癥狀明顯，體重大幅度上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1015，P＜0.000 1）。測(cè)定空腹?fàn)顟B(tài)下db/db小鼠的血糖，可高達(dá)20 mmol/L，耐受糖的能力明顯下降。表明HRM分型結(jié)果是準(zhǔn)確的，小鼠表型符合預(yù)期結(jié)果(見(jiàn)圖3）。

圖3 通過(guò)HRM鑒定的三種基因型小鼠的表型

3 討論

糖尿病在我國(guó)乃至全世界其發(fā)病率均呈逐年上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為全世界致死率極高的疾病之一。因其病因復(fù)雜，與多種因素相關(guān)，在研究和治療糖尿病方面還有諸多問(wèn)題亟待解決。與以往用的ob/ob小鼠相比，db/db小鼠糖尿病的發(fā)病進(jìn)程與人類T2DM相似，病程長(zhǎng)，病情穩(wěn)定，“三多一少”合并肥胖癥狀明顯，是現(xiàn)在應(yīng)用較為廣泛的一種糖尿病模型。而對(duì)于只是發(fā)生點(diǎn)突變的糖尿病小鼠模型的基因檢測(cè)，采用常規(guī)的基因測(cè)序和酶切法普遍存在耗時(shí)長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)高通量需求等問(wèn)題。HRM技術(shù)是近幾年興起的一種檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，能分析檢測(cè)出基因序列之間的微小差異[8-9]。本實(shí)驗(yàn)利用HRM技術(shù)建立了db/db小鼠的基因分型方法，減少了DNA提取樣品和試劑的消耗，并且通過(guò)對(duì)退火溫度的優(yōu)化，使其準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性更高。該方法省時(shí)省力、交叉污染小、結(jié)果準(zhǔn)確度高，在批量進(jìn)行db/db小鼠基因鑒定上值得大力推廣。

3.1 改良DNA提取方法，獲得純度較高的DNA產(chǎn)物

與以往的DNA提取方法相比，本實(shí)驗(yàn)采用了改良后的DNA提取法。因酚保存時(shí)間短，容易造成DNA產(chǎn)量降低和DNA碎片，從而會(huì)影響后面的基因分型結(jié)果[7]。而改良后的方法操作簡(jiǎn)便，大大減少了交叉污染的幾率，并且能夠得到高純度的DNA，提高基因分型的準(zhǔn)確性，適用于提取大量樣品。

3.2 優(yōu)化后的HRM方法鑒定db/db小鼠省時(shí)省力，準(zhǔn)確度高

隨著對(duì)基因領(lǐng)域研究的不斷深入，傳統(tǒng)的測(cè)序和酶切方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，而近幾年興起的HRM技術(shù)能夠具有高通量，快速，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[10]。在臨床研究，疾病診斷方面受到了很多科學(xué)家的賞識(shí)。另外，Gene Scan是一種用途十分廣泛的DNA片段分析技術(shù)，是將熒光標(biāo)記的DNA片段，如PCR產(chǎn)物，在測(cè)序儀上對(duì)其進(jìn)行片段大小、拷貝數(shù)量分析檢測(cè)的過(guò)程。用HRM方法分析樣品時(shí)，需要用到Gene Scan對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[11-12]。

本文以db/db小鼠為例，建立了qPCR-HRM基因分型方法，分型結(jié)果與DNA測(cè)序法結(jié)果高度一致，且分型結(jié)果與小鼠表型所體現(xiàn)出來(lái)的疾病狀態(tài)一致，說(shuō)明該方法鑒定db/db小鼠基因型的可靠性。通過(guò)對(duì)HRM反應(yīng)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，找到了最適的退火溫度，能夠更加準(zhǔn)確清楚的分辨出三種基因型的熔解曲線。在減少了DNA模板的濃度和反應(yīng)體系的體積之后，PCR擴(kuò)增依然能達(dá)到平臺(tái)期，沒(méi)有發(fā)生非特異性擴(kuò)增，效果好，在一定程度上減少了消耗。與DNA測(cè)序法相比，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力。整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中為閉管操作，污染小，同時(shí)一次可分析大量樣品，可用于大批樣本的檢測(cè)。

4 結(jié)論

隨著市場(chǎng)對(duì)db/db糖尿病小鼠模型的需求增加，利用HRM方法能夠提高鑒定db/db小鼠基因型的效率，利于db/db小鼠大規(guī)模生產(chǎn)，并且也寄希望于進(jìn)一步應(yīng)用到其他與db/db小鼠相似的小鼠模型的基因鑒定當(dāng)中去。