毛曉英 朱新榮 萬銀松 田洪磊 詹 萍 王丹丹

（石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子832000）

核桃除部分出口和國(guó)內(nèi)鮮食銷售外，加工成核桃油、核桃粉、核桃乳等產(chǎn)品比較普遍。蛋白質(zhì)不僅是核桃油生產(chǎn)副產(chǎn)物——脫脂粕的主要成分，也是加工核桃粉和核桃乳產(chǎn)品良好的原料。隨著我國(guó)人民生活水平的提高及人們對(duì)具有醫(yī)療保健功能的核桃食品認(rèn)識(shí)的提高，研究工作主要集中在核桃提油后的脫脂粕的研究。全面了解核桃蛋白質(zhì)組成是有效利用核桃脫脂粕這一核桃加工副產(chǎn)物的前提和基礎(chǔ)。

核桃蛋白質(zhì)，不僅是核桃油生產(chǎn)副產(chǎn)物——脫脂粕的主要成分，也是加工核桃粉和核桃乳產(chǎn)品良好的原料。由于各地核桃提油方法的不同，所以造成脫脂粕的成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)功能性差異比較大，致核桃蛋白質(zhì)很難廣泛地應(yīng)用到食品加工中。對(duì)核桃蛋白的分離提取研究，不僅有利于進(jìn)一步了解核桃蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也能得到制備高純度蛋白的方法。

根據(jù)核桃蛋白組成和性質(zhì)的研究報(bào)道[1-6]，核桃蛋白分離提取的方法普遍采用堿溶酸沉的方法制備核桃分離蛋白[7-9]。采用的不同核桃原料和處理方法，提取堿溶蛋白時(shí)的pH 值有一定差異，酸沉點(diǎn)有差異，使核桃分離蛋白的純度有一定差異，產(chǎn)品的功能性也有差異。本文研究獲得較高純度的核桃分離蛋白的最優(yōu)提取工藝，為進(jìn)一步研究核桃蛋白質(zhì)的功能性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃（Juglans Legia L.）購(gòu)于新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，屬新疆和田薄皮核桃。正己烷，氫氧化鈉，鹽酸，95%乙醇，85%磷酸等購(gòu)于上海化學(xué)試劑公司?？捡R斯亮藍(lán)G-250，牛血清白蛋白購(gòu)于上海生化試劑公司。氫氧化鈉，氫氧化鈣，碳酸鈉，均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1 高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；J6大容量冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科上海有限公司；CR21G 高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；90-1 恒溫磁力攪拌器，上海滬西分析儀器廠；HH-S 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；WH-1 微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；PHS 一3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃仁及脫脂粉基本成分的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照AOAC 950.48 的方法[10]，采用微量凱式定氮法測(cè)定，核桃蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.30。脂肪含量的測(cè)定參照AOAC 984.22 的方法測(cè)定[11]，樣品置于索氏提取器中，用石油醚來提取脂肪。灰分含量的測(cè)定參照AOAC 920.15 的方法[12]測(cè)定，將樣品置于525 ℃下煅燒4 h，稱量殘?jiān)馁|(zhì)量。水分含量的測(cè)定參照AOAC 925.40[13]的方法測(cè)定，將樣品在105 ℃±1 ℃的烘箱中干燥至恒重。碳水化合物含量的測(cè)定參照Zhu[14]的方法測(cè)定，碳水化合物含量的計(jì)算按照100%減去樣品的水分含量，灰分含量，脂肪含量及蛋白質(zhì)含量的總合。

1.3.2 蛋白質(zhì)氮溶解指數(shù)（NSI）的測(cè)定 將一定量的核桃蛋白樣品分散于去離子水中，于室溫下磁力攪拌1 h 后離心（10 000 g，30 min）。收集上清液，上清液中可溶解氮含量用微量凱氏定氮法[10]測(cè)定，以可溶解氮與樣品中總氮的百分比表示溶解度。

1.3.3 蛋白質(zhì)非蛋白氮（NPN）的測(cè)定 參考Wolf[15]和Wolf 等人[16]的方法，略改。稱取1.0 g 核桃脫脂粉，加入15 mL 10%（w/v）三氯乙酸溶液，在室溫下進(jìn)行磁力攪拌1 h，然后在室溫下于15 000 g 離心30 min。收集上清液，用微量凱氏定氮法測(cè)定上清液中的氮含量。NPN 含量用上清液含氮量與脫脂粉中總氮含量之比（百分?jǐn)?shù)）表示。

1.3.4 蛋白質(zhì)在不同溶劑中可溶解蛋白含量的測(cè)定 參考Venkatachalam[4]的方法，略改。稱取核桃脫脂粉1.0 g，加入溶劑10 mL，在室溫下磁力攪拌1 h。溶劑（最終提取液的pH）分別為：去離子水（pH 6.50），1.0 mol/L NaCl（pH 6.31），0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液 （pH 7.52），0.1 mol/L NaOH（pH 12.56），70%（V/V）乙醇溶液 （pH 6.28）0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.02）。不同溶劑提取后離心（15 000 g，30 min，室溫），收集上清液用微量凱氏定氮法[10]測(cè)定溶解蛋白質(zhì)的含量，不同溶劑溶解蛋白的含量單位為mg 蛋白質(zhì)/100 mg 脫脂粉。

1.3.5 核桃脫脂粉的制備 參照Sze-Tao 的方法[1]，略改。核桃仁用2% NaOH 浸泡4min（之前將核桃仁浸泡在水中0.5 h）的方法去除核桃仁皮后進(jìn)行烘干（45～48 ℃）、粉碎等工序，采用正己烷以1∶5（w/v）的料液比提取1 h，然后進(jìn)行抽濾，收集殘?jiān)龠M(jìn)行提取，以濾液為無色透明時(shí)，收集殘?jiān)?，置于通風(fēng)櫥揮干溶劑。將殘?jiān)梅鬯闄C(jī)粉碎后過150 目篩，即為核桃脫脂粉，置于冰箱4 ℃冷藏備用。

1.3.6 核桃蛋白組分的分離提取 參考Osborne[17]關(guān)于植物蛋白4 種蛋白的分離方法，以及參照Sze-Tao[1]關(guān)于核桃蛋白組分的分離方法，略改。以核桃脫脂粉為原料，按照?qǐng)D1的流程進(jìn)行清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白的分離提取，每步提取重復(fù)2 次，以利于蛋白組分的充分提取，收集不同組分的上清液，在4 ℃下透析48 h 后凍干，置于冰箱4 ℃冷藏備用。

圖1 核桃蛋白組分分離提取工藝流程圖Fig.1 Flow chart of walnut protein fractionation

1.3.7 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

蛋白質(zhì)提取率%=

1.3.8 核桃蛋白分離提取工藝的優(yōu)化

1）pH 對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響 以溶出蛋白質(zhì)為指標(biāo)，稱取1.0 g 脫脂粉，加入20 mL的去離子水（即料液比為1∶20，w/v），在室溫下進(jìn)行磁力攪拌，分別調(diào)節(jié)溶液的pH 為1～12，待溶液的pH 恒定后再進(jìn)行磁力攪拌浸提1 h，然后在室溫下以10 000 g 離心10 min，取一定量的上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同pH 條件下蛋白質(zhì)的提取率，確定最佳提取pH。

2）提取時(shí)間對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響以溶出蛋白質(zhì)為指標(biāo)，稱取1.0 g 脫脂粉，加入20 mL 的去離子水（即料液比為1∶20，w/v），在室溫下進(jìn)行磁力攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH 為11.0，待溶液的pH 恒定后分別進(jìn)行磁力攪拌0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 h，然后在室溫下以10 000 g 離心10 min，取一定量的上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同提取時(shí)間下蛋白質(zhì)的提取率，確定最佳提取時(shí)間。

3）料液比對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響以溶出蛋白質(zhì)為指標(biāo)，稱取1.0 g 脫脂粉，分別按料液比為1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（w/v），在室溫下進(jìn)行磁力攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH 為11.0，待溶液的pH 恒定后進(jìn)行磁力攪拌1 h，然后在室溫下以10 000 g 離心10 min，取一定量的上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同料液比下蛋白質(zhì)的提取率，確定最佳料液比。

4）提取溫度對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響以溶出蛋白質(zhì)為指標(biāo)，稱取1.0 g 脫脂粉，加入20 mL 的去離子水[即料液比為1 ∶20（m/V）]，在室溫下進(jìn)行磁力攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH 為11.0，待溶液的pH 恒定后分別調(diào)節(jié)溶液的溫度為：30，35，40，45，50，55，60，65 ℃進(jìn)行磁力攪拌1 h，然后在室溫下以10 000 g 離心10 min，取一定量的上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同提取溫度下蛋白質(zhì)的提取率，確定最佳提取溫度。

5）響應(yīng)面分析法優(yōu)化核桃蛋白質(zhì)提取條件綜合pH、提取時(shí)間、料液比、提取溫度等對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的單因素試驗(yàn)結(jié)果，由于pH 對(duì)核桃蛋白質(zhì)的提取率有很大影響，此外也影響提取蛋白質(zhì)的色澤，因此，固定提取pH 11，確定對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果影響比較顯著的其他三因素為：料液比、提取溫度、提取時(shí)間，采用響應(yīng)面法（RSM）（Box-Behnken 中心組合）對(duì)提取條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值。因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Levels and codes of variables chosen for response surface analysis

1.3.9 核桃堿溶蛋白酸沉點(diǎn)的確定 通過堿提得到核桃蛋白提取液后，要制備分離蛋白，需要將蛋白質(zhì)溶液沉淀下來，一般選擇酸沉工藝，即將蛋白質(zhì)提取液pH 調(diào)整到等電點(diǎn)。根據(jù)響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的核桃蛋白提取最佳條件參數(shù)，即提取pH 11，料液比1∶26，提取溫度53 ℃，提取1.5 h，得到的蛋白質(zhì)提取液，在室溫下以10 000 g 離心10 min，收集上清液，用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上清液的pH 分別為3，3.5，4，4.5，5，5.5，6。待蛋白液的pH穩(wěn)定后進(jìn)行磁力攪拌1 h，然后在室溫下以10 000 g 離心10 min，取一定量的上清液用Bradford 法[18]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/100 mg 脫脂粉）最低為核桃堿溶蛋白酸沉點(diǎn)。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 （Chicago，Illinois）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（LSD，P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃仁及核桃脫脂粉的基本成分的分析

新疆薄皮核桃仁主要成分見表2。結(jié)果顯示，新疆薄皮核桃仁蛋白質(zhì)含量高達(dá)17.66%，蛋白質(zhì)含量高于我國(guó)其它地區(qū)的核桃，如：云南大姚核桃（16.2%），小油籠核桃（13.6%）等[19]。此外，粗脂肪含量達(dá)60.84%，低于我國(guó)其它地區(qū)的核桃，如云南大姚核桃（73.88%），山東核桃（68.89%）[20]。與國(guó)外的核桃相比，新疆薄皮核桃蛋白質(zhì)含量高于美國(guó)核桃（16.66%），而粗脂肪含量低于美國(guó)核桃（66.90%）[1]，分析新疆薄皮核桃仁蛋白質(zhì)含量較高而粗脂肪含量較低的原因，可能由于新疆特殊的地理環(huán)境和氣候?qū)颂业纳L(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。

對(duì)新疆薄皮核桃仁進(jìn)行脫脂處理后得到的核桃脫脂粉的基本成分見表2。結(jié)果顯示，脫脂后的核桃粉粗脂肪降至1.80%，蛋白質(zhì)含量為52.51%，水分含量變化比較大，為9.20%，灰分降至0.54%。核桃脫脂粉的NPN 為3.74%，NSI 為7.64%，相比較脫脂大豆蛋白的NSI （75.3%）[21]要低得多。新疆薄皮核桃脫脂粉較低的NSI 會(huì)增加核桃蛋白產(chǎn)品的溶解難度，因此，通過一定的工藝處理制備核桃蛋白產(chǎn)品將有助于核桃蛋白質(zhì)的溶解度的增加。

表2 核桃仁及核桃脫脂粉的主要成分Table 2 Components of walnut kernel and defatted walnut flour

2.2 不同溶劑對(duì)核桃脫脂粉蛋白溶解度的影響

圖2 不同溶劑對(duì)核桃脫脂粉蛋白溶解度的影響Fig.2 Influence of solubilising agent on defatted walnut flour protein solubility

用微量凱氏定氮法測(cè)定不同溶劑提取核桃脫脂粉中可溶性蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果見圖2。6 種不同的溶劑中，0.1 mol/L NaOH 溶液溶解蛋白量最高，溶解蛋白質(zhì)可達(dá)45.89 mg/100 mg 脫脂粉；70%乙醇溶液溶解蛋白量最低，溶解蛋白質(zhì)僅為3.23 mg/100 mg 脫脂粉；0.1 mol/L Tris-HCl 溶解蛋白質(zhì)量與1 mol/L NaCl 溶液溶解蛋白量比較相似，分別為10.67 mg/100 mg 脫脂粉和8.98 mg/100 mg脫脂粉。上述研究結(jié)果與Sze-Tao 等[1]的研究結(jié)果比較相似，但溶解蛋白含量均比Sze-Tao 的研究結(jié)果低，可能是微量凱氏定氮法測(cè)定[3]結(jié)果比Lowry 法[22]測(cè)定結(jié)果偏低的原因。Venkatachalam等人[4]比較了Lowry 法和微量凱氏定氮法測(cè)定美國(guó)山核桃的蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微量凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果普遍比Lowry 法測(cè)定結(jié)果低。以上結(jié)果表明，核桃蛋白質(zhì)在堿性溶液中蛋白質(zhì)溶出率比較高，而在70%乙醇溶液和去離子水中蛋白質(zhì)溶出率比較低，這說明堿液是核桃蛋白質(zhì)比較好的溶劑。

2.3 核桃蛋白組成及含量分析

以核桃脫脂粉為原料，按照核桃蛋白組分分離工藝流程圖（見圖1）的步驟進(jìn)行分離得到核桃蛋白組成為：谷蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。4種核桃蛋白質(zhì)組分在核桃總蛋白質(zhì)中所占的比例即含量見圖3。結(jié)果顯示，清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、 球蛋白的含量分別是7.54%，4.73%，72.06%，15.67%。由此可以看出，谷蛋白是構(gòu)成核桃蛋白組成的主要部分，含量超過了70%，這與Sze-Tao 等[1]研究的美國(guó)核桃（Juglans Legia L.）結(jié)果基本一致，同時(shí)與Venkatachalam 等[4]研究的山核桃（Carya illinoinensis）結(jié)果相似，這主要是因?yàn)檠芯繉?duì)象都屬于核桃科胡桃屬植物。球蛋白排第二，占核桃蛋白的14.08%，其次清蛋白占7.54%，含量最少的是醇溶蛋白，占4.73%。核桃蛋白質(zhì)的組成與巴旦杏[23]、腰果[24-25]和開心果[26]等堅(jiān)果的蛋白組成有一定差異，巴旦杏、腰果和開心果等堅(jiān)果的蛋白組成中含有大量的球蛋白和清蛋白，其中，球蛋白含量占總蛋白的40%以上。此外，核桃蛋白的組成與豆科類蛋白組成明顯不同，豆類蛋白質(zhì)沒有醇溶蛋白，以球蛋白為主，占60%～70%，其次還包括清蛋白（15%～21%）、谷蛋白（10%～15%），其中大豆中球蛋白占60%～90%[27-28]，花生含90%球蛋白和10%的清蛋白[29]。谷物中，大米蛋白由75%～79%谷蛋白，13%～15%球蛋白，4.5%～6%清蛋白，小于3%的醇溶蛋白構(gòu)成[30-31]，相比之下，核桃蛋白的組成與大米蛋白比較相似。由于谷蛋白是構(gòu)成核桃蛋白的主要組成，核桃蛋白的NSI 較豆科類蛋白低很多。

圖3 核桃蛋白組分及含量Fig.3 Content of walnut protein fractions

2.4 核桃蛋白提取條件的研究

2.4.1 pH 對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響 pH 對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響見圖4。由圖4可以看出，pH 對(duì)核桃脫脂粉中蛋白質(zhì)的提取率有顯著的影響（P<0.05）。核桃蛋白質(zhì)在中性和酸性pH 中提取率比較低，尤其在酸性條件下，如pH 3～7 之間，核桃蛋白質(zhì)的提取率最低，低于10%以下，這與Sze-Tao 等人[1]的研究結(jié)果一致。在pH 1～2 之間，蛋白質(zhì)的提取率在15%～18%，在堿性條件下，隨著pH 的升高，蛋白質(zhì)的提取率逐漸提高。pH 8以后，隨著pH 的升高，提取率顯著增加，到pH 11時(shí)，提取率達(dá)71.12%，隨后提取率增加緩慢，到pH 12 時(shí)，提取率達(dá)75.23%。上述研究結(jié)果與本論文第二章中核桃蛋白質(zhì)的組分研究結(jié)果剛好吻合，由于谷蛋白是核桃蛋白的主要組成成分，占核桃總蛋白的70%以上，因此，在堿性條件下，由于大部分谷蛋白和少量球蛋白和清蛋白溶出，所以核桃蛋白的提取率較高。Venkatachalam 等人[4]也得到相似的研究結(jié)果。由于pH 11 以后，核桃蛋白質(zhì)的提取率提高不顯著，且核桃蛋白質(zhì)提取液的顏色開始發(fā)生褐變，可能由于核桃蛋白質(zhì)含有單寧。Osborne 和Campbell[32]報(bào)道了英國(guó)核桃蛋白質(zhì)包含3.5%（w/w）的球蛋白，之后在核桃仁除去單寧后核桃蛋白質(zhì)中的球蛋白的得率提高到20%[33]。這些早期的研究結(jié)果表明，核桃仁中單寧物質(zhì)的存在能極大的影響核桃球蛋白的溶解度。綜合考慮提取率和提取蛋白的色澤，選取pH11為核桃蛋白質(zhì)最佳提取pH。

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取率的影響見圖5。由圖5可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃蛋白的提取率逐漸提高。提取時(shí)間從0.5 h 增加到1 h，核桃蛋白質(zhì)的提取率顯著提高，從62.23%提高到71.02%，隨后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。在提取初期，核桃蛋白質(zhì)沒有完全溶解，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃蛋白質(zhì)的溶出量不斷增加。當(dāng)核桃蛋白質(zhì)的溶出量增加到一定程度后，在固定的條件下，由于核桃蛋白質(zhì)大部分已經(jīng)溶解出來，即使再增加提取時(shí)間，也只能有很少的蛋白質(zhì)繼續(xù)溶出，因此，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃蛋白質(zhì)的提取率增加緩慢。綜合考慮節(jié)約能源和蛋白質(zhì)提取率等因素，提取時(shí)間為1 h 為核桃蛋白的最佳提取時(shí)間。

2.4.3 料液比對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響 料液比對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響見圖6。由圖6可以看出，隨著料液比的不斷增加，核桃蛋白的提取率逐漸增加。Venkatachalam 等人[4]和劉淼[34]也得到了相似的研究結(jié)果。當(dāng)料液比從1∶5（m/V）增加到1 ∶20 （m/V）時(shí)，核桃蛋白質(zhì)的提取率顯著提高，從52.76%提高到71.89%，隨后，隨著料液比的繼續(xù)增加，當(dāng)料液比從1∶20 （m/V）增加到1∶50（m/V）時(shí)，核桃蛋白質(zhì)的提取率增加緩慢，從71.89%增加到78.12%。當(dāng)料液比較小的時(shí)候，蛋白質(zhì)沒有完全溶出，隨著料液比的增加，增加了水分子與蛋白質(zhì)分子的相互接觸，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解，因此，蛋白質(zhì)提取率顯著提高。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)基本已完全溶出，在現(xiàn)有的條件下，即使繼續(xù)增加料液比，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解無顯著提高作用。綜合考慮蛋白質(zhì)的提取工藝和提取率，以料液比為1∶20（m/V）為最佳提取蛋白料液比。

2.4.4 提取溫度對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響提取溫度對(duì)核桃蛋白提取效果的影響見圖7。由圖7可以看出，隨著提取溫度的升高，核桃蛋白提取率逐漸提高，當(dāng)提取溫度達(dá)50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為77.98%。當(dāng)溫度升至55 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率有少量增加，隨后，蛋白質(zhì)提取率隨溫度的升高不斷下降，當(dāng)溫度達(dá)70 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為64.67%。劉淼[34]和姜榮慶[9]也得到了相似的研究結(jié)果。當(dāng)提取溫度較低時(shí)，水分子和蛋白質(zhì)分子不能充分進(jìn)行相互作用，因而蛋白質(zhì)提取率較低，當(dāng)提取溫度逐漸升高時(shí)，對(duì)水分子和蛋白質(zhì)分子的相互作用有一定的促進(jìn)作用，有利于蛋白質(zhì)溶解度的提高，因而，升高溫度對(duì)于核桃蛋白質(zhì)的提取率有一定提高作用。當(dāng)提取溫度升高到一定值時(shí)，這時(shí)高溫可能引起部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性而發(fā)生聚集，從而使蛋白質(zhì)溶出量減少，此外，高溫可能引起核桃脫脂粉中其他成分如碳水化合物黏度增大而與蛋白質(zhì)發(fā)生粘合[35]，從而使核桃蛋白質(zhì)的提取率下降。綜合考慮蛋白質(zhì)提取率和蛋白提取工藝，以50 ℃為核桃蛋白質(zhì)最佳提取溫度。

圖4 pH 對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.4 Effect of pH on walnut protein extraction

圖5 提取時(shí)間對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on walnut protein extraction

圖6 料液比對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.6 Effect of flour-to-solvent ratio on walnut protein extraction

圖7 提取溫度對(duì)核桃蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on walnut protein extraction

2.4.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化核桃蛋白質(zhì)提取條件綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋白質(zhì)的提取率為響應(yīng)值，作響應(yīng)面分析試驗(yàn)（3 因素3 水平）。其中，以液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）為自變量。方案與結(jié)果見表3。

通過對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：Y=78.48+4.95X1+0.35X2+1.14X3+0.082X1X2+0.90X1X3+0.52X2X3-4.89X12-0.75X22-0.59X32，通過方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察模型的可靠性，見表4。

表3 方案及結(jié)果Table 3 Program and results of response surface analysis

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

由表4可知，模型P＜0.0001，表明回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)F=2.78527＜（F0.05（9，3）=8.81），P=0.1738＞0.05，在P=0.05 水平上影響不顯著，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.9959）。模型的調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.9906，說明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型來分析和預(yù)測(cè)核桃蛋白提取條件。

由表4可知，三因素中，液料比與提取時(shí)間，提取溫度與提取時(shí)間有交互作用，液料比X1、提取時(shí)間X3達(dá)到極顯著程度，核桃蛋白提取率的影響因素主次為液料比＞提取時(shí)間＞提取溫度。

由圖8的等高線可以看出，在提取溫度為50℃時(shí)，液料比和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的交互作用顯著。隨著液料比和提取時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)出先快速增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。單因素結(jié)果與優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果一致，因此，適當(dāng)?shù)脑黾恿弦罕群吞崛r(shí)間，有利于蛋白質(zhì)的溶出，使蛋白質(zhì)提取率提高。

由圖9的等高線可以看出，液液比為20∶1（v/w）時(shí)，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的交互作用顯著。隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增加后稍有減少的趨勢(shì)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與單因素結(jié)果基本一致，由此可見，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間，升高提取溫度有利于蛋白質(zhì)的溶出，從而提高了蛋白質(zhì)的提取率。

圖8 Y=f（X1，X3，50 ℃）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Responsive surfaces of Y=f（X1，X3，50 ℃）

圖9 Y=f（X2，X3，20∶1 v/w）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Responsive surfaces of Y=f （X2，X3，20∶1 v/w）

2.5 核桃蛋白提取條件的確定

通過響應(yīng)面分析并優(yōu)化，得到了提取pH 11，液料比26.03 ∶1、提取溫度53.07 ℃、提取時(shí)間1.5 h，為最優(yōu)核桃蛋白提取條件，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)提取率為81.05%。

2.6 驗(yàn)證優(yōu)化蛋白質(zhì)提取條件

采用數(shù)學(xué)模型優(yōu)化蛋白質(zhì)提取條件，從而驗(yàn)證響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)果，且取整數(shù)即：pH 11，液料比26 ∶1（v/w），提取時(shí)間1.5 h，提取溫度53 ℃，進(jìn)行6 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得蛋白質(zhì)提取率為82.68%±0.29%。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的核桃蛋白提取條件準(zhǔn)確可靠。

2.7 核桃堿溶蛋白酸沉點(diǎn)的確定

由pH 對(duì)核桃蛋白提取率的影響結(jié)果可以看出，核桃蛋白在堿性條件下的提取率比在酸性條件下高，且在堿性條件下，隨著pH 的升高，蛋白質(zhì)提取率迅速增加。在確定為pH 11 的條件下，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化核桃蛋白提取條件，即料液比26∶1（v/w），提取溫度53 ℃，提取時(shí)間1.5 h，得到的蛋白提取液為堿溶蛋白，其經(jīng)過離心，酸沉可以將其分離從而得到核桃分離蛋白。圖10為核桃堿溶蛋白在不同的pH 條件下酸沉、 離心后上清液的可溶性蛋白含量（mg/100 mg 脫脂粉）。由圖10可以看出，在pH 4～5 之間，核桃堿溶蛋白的酸沉量是比較大的。在pH 4.5 條件下酸沉后上清液可溶性蛋白含量最低，說明大部分核桃堿溶蛋白在pH 4.5 可以酸沉下來。這一結(jié)果與Sze-Tao K W C等人[1]和姜莉[8]、崔莉[7]的研究結(jié)果略有些差異。Sze-Tao K W C 等人用0.1 mol/L NaOH（pH 12）溶解核桃脫脂粉，得到的核桃蛋白提取液在不同pH 條件下的蛋白質(zhì)溶解度結(jié)果表明，pH 4 時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最低。姜莉和崔莉都采用pH 8.5 的條件下提取核桃蛋白，并測(cè)定了蛋白液的等電點(diǎn)分別為pH 4.5 和pH 5。結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能是提取蛋白質(zhì)溶液pH 不同以及酸沉點(diǎn)pH 的劃分不同，但結(jié)果表明，核桃堿溶蛋白的等電點(diǎn)基本為pH 4～5。

圖10 不同pH 對(duì)上清液的可溶性蛋白的影響Fig.10 Effect of pH on soluble protein of supperents

2.8 核桃分離蛋白的制備工藝

參照Wolf[36]制備大豆分離蛋白的方法，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化核桃蛋白提取條件以及核桃堿溶蛋白酸沉點(diǎn)的結(jié)果，本試驗(yàn)采用核桃脫脂粉為原料，按照以下工藝制備核桃分離蛋白，得到的核桃分離蛋白，純度為90.5%，得率為43.15%。此法制備的核桃蛋白純度比姜榮慶[9]和姜莉[8]分別采用堿提法提取制備出的核桃蛋白質(zhì)純度 （分別為82.46%、83%）高。由此結(jié)果可以看出，按照以下堿溶酸沉工藝制備的核桃分離蛋白基本達(dá)到分離蛋白純度的要求。

核桃脫脂粉→95%醇洗（1∶10，w/v）→過濾得濾餅→揮干溶劑→蛋白質(zhì)溶液 （1∶26（w/v））→調(diào)蛋白液pH 11 →攪拌1.5 h （53 ℃）→離心（7 000 g，15 min，25 ℃）→上清液 →調(diào)pH 為4.5 →攪拌1 h →離心 （7 000 g，15 min，25 ℃）→沉淀→水洗至中性→凍干。

3 結(jié)論

通過對(duì)核桃及核桃蛋白的組成分析研究，發(fā)現(xiàn)核桃蛋白4 種組成蛋白谷蛋白、 清蛋白、 球蛋白、醇溶蛋白中，谷蛋白含量最高，達(dá)72.06%。正是基于核桃蛋白的組成，采用堿性條件溶解核桃蛋白，通過響應(yīng)面優(yōu)化核桃蛋白分離提取工藝，得到核桃分離蛋白純度為90.5%，得率為43.15%。說明堿溶酸沉的方法是核桃蛋白比較有效的分離提取方法。

但是，由于谷蛋白是構(gòu)成核桃蛋白的主要組成，核桃蛋白的NSI 較豆科類蛋白低很多。這也為核桃蛋白產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提高了難度。這就需要采用一定安全的方法對(duì)核桃蛋白進(jìn)行適度處理改性，以提高其NSI，有助于提高產(chǎn)品品質(zhì)，例如適度酶解可以提高其NSI。關(guān)于核桃蛋白的適度酶解提高其溶解度有待于進(jìn)一步研究。