耿麗娜,張璧珠,李寶亮

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，河北張家口 075000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全球范圍分布廣泛，其中發(fā)展中國家感染率較高，據報道我國HBV攜帶率高達10%～20%[1]。HBV感染除了引起肝臟病變外，還可導致全身多器官疾病，其中腎小球腎炎較為常見。1971年，COMBES等[2]首次發(fā)現HBV感染與膜性腎病有關，掀起了國內外研究HBV感染與腎臟疾病關系的浪潮。直到1989年在我國召開的乙型肝炎病毒相關性腎炎座談會上，正式將該病命名為乙型肝炎病毒相關性腎炎(HBV-GN)，是指由HBV直接或間接誘發(fā)的腎小球腎炎，經血清免疫學及腎活檢免疫熒光所證實，并除外與腎臟疾病相關、病因明確的其他繼發(fā)性腎小球腎炎(如狼瘡性腎炎)的一種疾病[3]。我國HBV攜帶者中HBV-GN的發(fā)生率較高，約為6.8%～20%[4]。已有研究報道在狼瘡腎炎中自身抗體具有一定的診斷價值[5-6]，并且另有研究發(fā)現在HBV-GN中自身抗體有一定的增高，但尚未有研究揭示自身抗體在HBV-GN中的診斷和預測價值。由于感染HBV的患者中HBV-GN發(fā)病率較高，目前可預測疾病的指標較少，所以本研究著眼于探索有助于預測HBV-GN發(fā)病的免疫學指標——自身抗體，為此病的早期診斷和預防提供有價值的信息。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入研究者為2015年8月至2017年7月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院首次就診患者，分組及入選標準如下。(1)HBV-GN組：23例，診斷標準依據1989年HBV-GN座談會上制定的標準[3]。血清HBV抗原陽性；患腎小球腎炎，并排除狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎小球疾??；腎切片上找到HBV抗原。入組的所有患者臨床癥狀和實驗室診斷均未達到自身免疫病的診斷標準：首先患者病史無自身免疫病，其次患者均未表現出自身免疫病的臨床癥狀，再次患者外周血免疫球蛋白、紅細胞沉降率(ESR)和C-反應蛋白(CRP)結果均未表現出異常，但部分患者補體水平降低，可能與形成的免疫復合物有關。(2)HBV非GN組：25例，血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性，經病理切片檢查和血清學檢測已排除相關腎小球腎炎。(3)健康對照組25例，血清HBsAg陰性，無腎小球腎炎和其他相關自身免疫性疾病的體檢健康者。HBV-GN組男19例、女4例；平均年齡25歲；經實驗室檢查所有患者血清HBsAg均為陽性，24 h尿蛋白均在3.5 g以上，且腎組織切片中乙肝抗原(HBsAg或HBcAg)陽性；病理類型顯示其中膜性腎病17例，膜增生型腎小球腎炎5例，系膜增生型腎小球腎炎1例。HBV非GN組男19例、女6例，平均年齡為28歲;經實驗室檢查所有病例血清HBsAg均為陽性且24 h尿蛋白均低于3.5 g，腎組織切片乙肝抗原為陰性。健康組男18例、女7例，平均年齡為26歲;經實驗室檢查血清HBsAg均為陰性，24 h尿蛋白均低于3.5 g，腎組織切片乙肝抗原均為陰性。

本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者在研究開始前簽署知情同意書。

1.2主要儀器 全自動間接免疫熒光操作/酶聯免疫一體機：Sprinter XL；全自動免疫印跡儀：EUROBlotMaster Ⅱ-50；熒光顯微鏡：EUROStar Ⅲ Plus。

1.3方法 臨床上檢測自身抗體有多種方法，其中最重要和最常用的是間接免疫熒光法檢測抗核抗體和免疫印跡法檢測抗可溶性核抗原(ENA)抗體譜。采用間接免疫熒光法檢測血清抗核抗體(ANA)，滴度>1∶100為陽性，具體操作步驟如下：(1)將血清樣本稀釋100倍，滴加25 μL稀釋后樣本至加樣板，與載片覆有生物薄片的一面接觸，室溫溫育30 min；(2)用PBS吐溫緩沖液流水沖洗載片，立即將其浸入裝有PBS吐溫緩沖液的燒杯中浸泡至少5 min；(3)滴加20 μL FITC標記的抗人IgG至潔凈的加樣板，將浸泡后的載片蓋在加樣板上與抗人IgG接觸，室溫溫育30 min；(4)重復步驟(2)；(5)滴加約10 μL封片介質至蓋玻片，將浸泡后的載片蓋在蓋玻片上，顯微鏡下觀察熒光模型。

免疫印跡法檢測血清自身抗體譜，包括nRNP、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白和AMA-M2等14種不同抗原的IgG類抗體。具體操作步驟如下：(1)將膜條放入溫育槽內，加入1.5 mL樣本緩沖液，在搖床上溫育5 min后吸去溫育槽中的液體；(2)在溫育槽中加入1.5 mL稀釋100倍的血清樣本，在搖床上室溫溫育30 min；(3)吸去槽內液體，用1.5 mL清洗緩沖液清洗膜條3次，每次5 min；(4)在槽內加入1.5 mL酶結合物，搖床上室溫溫育30 min；(5)重復步驟(3)；(6)在槽中加入1.5 mL底物液，搖床上室溫溫育10 min；(7)吸去槽內液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次1 min；(8)將膜條放在結果判定模板中，風干后判斷結果。

以上試劑均來自于德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷有限公司，所有步驟均根據說明書嚴格執(zhí)行。

2 結 果

2.1HBV-GN組、HBV非GN組及健康組間ANA和抗ENA抗體譜陽性率分析 檢測HBV-GN組、HBV非GN組及健康組血清中ANA和抗ENA抗體譜，分別對3組間ANA和抗ENA抗體譜陽性率進行比較。結果顯示，與HBV非GN組和健康組相比，HBV-GN組ANA以及抗ENA抗體譜陽性率均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中HBV-GN組ANA和抗ENA抗體譜雙陽性的樣本為8例，HBV非GN組ANA和抗ENA抗體譜雙陽性的樣本為2例，見表1。

表1 3組ANA和抗ENA抗體譜陽性率分析[n(%)]

注：HBV-GN組與HBV非GN組比較，aP<0.01；HBV-GN組與健康組比較，bP<0.01

2.2ANA核型及抗ENA抗體譜分析 經過分析實驗數據，本文發(fā)現HBV-GN組ANA核型主要為核顆粒型(47.8%)，其次為胞漿顆粒型(13.0%)，抗ENA抗體譜主要為Ro-52(17.5%)和AMA-M2(17.5%)；HBV非GN組ANA同樣以核顆粒型為主(16%),見表2。

表3 HBV-GN和HBV非GN組ANA核型和抗ENA抗體譜陽性率分析[n(%)]

2.3HBV非GN組自身抗體陽性更易發(fā)生HBV-GN 為研究自身抗體與乙肝患者發(fā)生HBV-GN的關系，本文對HBV-非GN組進行了為期12個月的隨訪，結果發(fā)現7例自身抗體陽性患者中有5例發(fā)生了HBV-GN，而自身抗體陰性患者中無1例發(fā)生(圖1，P=0.000)。

圖1 HBV-GN發(fā)生率曲線

3 討 論

多數腎小球腎炎是由免疫介導的炎癥疾病，其中繼發(fā)性腎炎最常見的是HBV-GN和系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎。許多研究已發(fā)現系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病理性自身抗體參與了狼瘡腎炎的發(fā)病，且有助于疾病的診斷[5-6]，但目前尚未有研究報道自身抗體在HBV-GN的臨床應用，筆者在本研究中首次探討了自身抗體在乙型肝炎相關性腎炎中的預測和早期診斷價值。自身抗體現已廣泛應用于多種自身免疫性疾病或自身免疫功能紊亂相關性疾病的臨床診斷及預后判斷[7-9]。CACOUB等[10]發(fā)現HBV感染人體細胞后可以誘發(fā)自身免疫反應，繼而產生多種自身抗體，LEI等[11]發(fā)現慢性HBV感染患者ANA和ENA陽性率達65%，張曉紅等[12]發(fā)現慢性乙肝患者血清ANA陽性率為16.7%，以上研究表明有相當一部分乙肝患者體內存在自身抗體，但有很少研究關注增高的自身抗體對乙肝患者的預后產生哪些影響。

本研究發(fā)現HBV-GN患者與HBV非GN患者相比，血清抗核抗體和抗ENA抗體譜陽性率顯著增高，分別高達73.9%和43.5%，于是本文認為自身抗體是否與乙肝患者發(fā)生腎炎有關。腎臟可以通過多種機制成為自身抗體的受害者，自身抗體可損傷腎小球或腎組織特異性抗原，如膜性腎病[13]，抗腎小球基底膜腎炎[14]和IgA腎病[15]等。有研究發(fā)現[16]，免疫復合物可以改變腎臟基底膜的結構，激活補體的經典路徑，加劇C3a和C5a等趨化因子的炎癥過程，另外由于C5b-9復合物的細胞溶解作用，補體末端通路也會導致細胞損傷。以上研究表明增高的自身抗體可致腎臟損傷，引起一系列腎臟疾病。

本實驗發(fā)現，有28%的乙肝非腎炎患者血清自身抗體陽性，本文認為可能這部分患者尚未發(fā)生HBV-GN或因其他某些原因尚未致病。為了證實乙肝患者發(fā)生HBV-GN是否與自身抗體有關，本文對25例乙肝非腎炎患者進行了為期1年的隨訪，發(fā)現7例自身抗體陽性的乙肝患者在1年內有5例發(fā)生了HBV-GN，并且自身抗體陰性的患者無1例發(fā)生HBV-GN。以上結果均表明自身抗體在HBV-GN的預測和早期診斷中可能具有重要的意義，故對自身抗體陽性的乙肝患者進行定期監(jiān)測或提早干預，有利于預防乙肝患者HBV-GN的發(fā)生。另外2例自身抗體陽性的乙肝患者可能因隨訪時間較短或自身抗體轉陰而未發(fā)生腎炎，筆者將對病例繼續(xù)跟蹤。

4 結 論

綜合本次研究的結果，HBV-GN患者比HBV非GN患者自身抗體陽性率增高，且自身抗體陽性的乙肝患者比自身抗體陰性的乙肝患者更易發(fā)生HBV-GN，說明自身抗體在HBV-GN疾病中有一定的預測價值。對自身抗體陽性的乙肝患者進行早期干預，可能會減少 HBV-GN的發(fā)生，具體干預方法有待進一步研究。