李 珂 綜述,胡志敏 審校

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430022)

迷迭香酸(RA)是一種天然存在的水溶性多酚類化合物。它分布廣泛，常見于唇形科、紫草科、葫蘆科和傘形科的物種，比如迷迭香、鼠尾草和紫蘇。迷迭香酸的化學(xué)名稱是[R(E)]α-〔[3-(3，4-二羥基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基〕-3，4-二羥基苯丙酸。(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)迷迭香酸可以由L-苯丙氨酸和L-酪氨酸通過包含苯丙氨酸氨裂解酶和肉桂酸4-羥化酶在內(nèi)的8種酶合成而來[1]，也可以通過咖啡酸和3,4-二羥基苯基乳酸的酯化來化學(xué)生產(chǎn)[2]，也可以直接從植物中提取。目前，由于RA及其衍生物有著抗炎癥、抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤和抗微生物等功能，引起了人們對它的興趣。在臨床上，RA能減弱T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，減輕過敏性鼻炎、哮喘的癥狀，還能減緩阿爾茨海默病的發(fā)展。不僅如此，迷迭香酸在制藥、食品和化妝品等領(lǐng)域也有著巨大的價(jià)值。隨著迷迭香酸的用途越來越廣，其需求量也會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。因此，對迷迭香酸進(jìn)行研究有著重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的市場前景。

圖1 迷迭香酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 迷迭香酸的生產(chǎn)及其衍生物

目前主要通過化學(xué)合成、生物合成、酶法合成和植物中提取的方法來制備迷迭香酸。同時(shí)也在研究植物生物技術(shù)來為RA的生產(chǎn)提供替代系統(tǒng)。

1.1化學(xué)法 迷迭香酸的化學(xué)合成路線主要有以下3種：(1)以胡椒基氯或胡椒醛為原料合成迷迭香酸及其衍生物，總收率在5%左右；(2)以(S)-酪氨酸為原料經(jīng)7步反應(yīng)合成了具有旋光性的(S)-(-)-迷迭香酸，總收率在9%；(3)以甲基作為羥基保護(hù)基，以藜蘆醛為起始原料，經(jīng)Erlenmeyer-Plochi反應(yīng)、水解開環(huán)、還原、保護(hù)、縮合、脫保護(hù)等7步反應(yīng)，完成(±)-迷迭香酸的合成[3-4](圖2)。前兩種方法收率較低而且成本高昂，第3種方法將收率提高到了30%。但化學(xué)法整體存在得率低、產(chǎn)物光學(xué)純度不高、成本高昂，污染環(huán)境等缺點(diǎn)。

圖2 3種合成迷迭香酸的化學(xué)方法

1.2生物法 生物合成的途徑包括苯丙氨酸和酪氨酸 2 條平行分支途徑，在這個(gè)過程中有8種酶起到了重要的作用，該合成途徑起始于芳香族氨基酸L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。苯丙氨酸解氨酶(PAL)，肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸CoA-連接酶(4CL)在L-苯丙氨酸脫氨基轉(zhuǎn)化為咖啡酸的過程中起著重要的作用。而 L-酪氨酸則轉(zhuǎn)化為4-羥基苯基乳酸，其中L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為4-羥苯丙酮酸(pHPP)涉及了酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)和羥基苯丙酮酸還原酶(HPPR)。生物法的反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物立體選擇性高、對環(huán)境友好，是一種新的趨勢。

1.3浸漬法 將植物研磨后過篩，按其重量的20倍量加入50%乙醇，室溫浸泡4 h并攪拌，分離提取液，殘?jiān)尤朐参镏亓康?0倍后再加入50%乙醇，室溫浸泡6 h并攪拌，分離提取液，離心后過濾除雜。加入抗壞血酸到濾液中，靜置6 h后過濾去除沉淀。用dH2O將濾液醇濃度調(diào)節(jié)至20%，加到聚酰胺柱，用不同濃度的乙醇去洗柱，收集60%乙醇洗脫時(shí)的流出液，然后在60 ℃、-0.1 Mpa的條件下減壓脫醇濃縮，低溫放置析出顆粒狀迷迭香酸，最后真空減壓干燥結(jié)晶[5]。

1.4植物生物技術(shù) 當(dāng)從自然界中提取某種物質(zhì)變得越來越困難時(shí)，植物生物技術(shù)可以為其生產(chǎn)提供替代系統(tǒng)。 產(chǎn)生植物化學(xué)物質(zhì)的植物細(xì)胞培養(yǎng)物相對于該領(lǐng)域的植物培養(yǎng)物具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：可以在世界任何地方收集所需產(chǎn)物，同時(shí)保持嚴(yán)格的生產(chǎn)和質(zhì)量控制；不需要除草劑和殺蟲劑；避免與氣候或生態(tài)有關(guān)的問題；生長周期較短。然而，盡管具有這些優(yōu)點(diǎn)，但很少有能夠成功生產(chǎn)具有活性化合物的例子，這可能是由于缺乏植物次生代謝及其體外培養(yǎng)的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。植物生物技術(shù)通過鑒定參與生產(chǎn)和控制特定次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因和酶，并將其應(yīng)用于植物次生代謝工程中。對其細(xì)胞系的選擇、培養(yǎng)基的改良、生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，配合新的高通量轉(zhuǎn)錄分析方法(微陣列，cDNA-AFLP)和蛋白質(zhì)組學(xué)來提高其產(chǎn)量。

1.5RA及其衍生物 最著名的RA衍生物，紫草酸(C27H22O12)是RA和咖啡酸的綴合物。 紫草酸B(C36H30O16)是一種更復(fù)雜的咖啡酸酯，存在于紫草科植物中。Eritrichin(C26H20O10)是一種咖啡酸三聚體，最初是從齒緣草的愈傷組織和根培養(yǎng)物中分離出來的。Rabdosiin(C36H30O16)和Sagerinic acid(C36H32O16)是從毛葉香茶菜分離出的咖啡酸的四聚體[6]。從云南鼠尾草中分離出了8種云南酸，云南酸A(C54H46O24)包括云南酸C(C27H22O12)和D(C27H24O12)，它們是咖啡酸的三聚體。云南酸B(C54H46O25)是云南酸C的二聚體。云南酸E(C27H24O14)和F(C29H26O14)都是云南酸C的生物遺傳衍生物。芳基萘型木脂素酯，云南酸G(C36H30O16)和H(C36H26O16)，則是由兩個(gè)RA分子之間的氧化耦聯(lián)衍生而來的(圖3)。

1.6RA衍生物的生物活性 RA的衍生物紫草酸既能夠激活Nrf2-HO-1和Sirt1的表達(dá)并抑制INF-γ和IL-1β誘導(dǎo)的p-p38和p-JNK來發(fā)揮抗炎和細(xì)胞保護(hù)的作用；紫草酸也能減少清蛋白尿，脂質(zhì)過氧化，腎小球肥大和腎小球系膜擴(kuò)張來治療糖尿病腎病；還能降低血清中8-羥基脫氫鳥甘酸(8-OHdG)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hsCRP)、細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達(dá)，從而預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變。RA的衍生物Rabdosiin能夠減少β-氨基己糖苷酶的表達(dá)并激活透明質(zhì)酸酶，抑制炎癥，氧化和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起到抗炎癥和抗過敏的作用；對HIV-1整合酶的活性也有抑制作用，起到抗HIV的作用。

圖3 迷迭香酸及其一些衍生物的結(jié)構(gòu)

2 RA的作用

由于RA在作為藥物或膳食補(bǔ)充劑時(shí)能夠在人類健康方面發(fā)揮積極的作用，對癌癥和動(dòng)脈硬化等疾病的預(yù)防有著極大的潛能，同時(shí)RA是一種天然的抗氧化劑，在化妝品領(lǐng)域中也體現(xiàn)出了重要地應(yīng)用價(jià)值，因此對迷迭香酸的研究在過去幾年中大幅增加。

2.1抗微生物作用

2.1.1抗細(xì)菌作用 RA對細(xì)菌具有抑制作用，將接種了金黃色葡萄球菌的菌液分成兩組，一組添加0.1 %的RA，一組作為空白對照，每間隔1 h測定其蛋白濃度。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，添加了RA的菌液中蛋白濃度遠(yuǎn)高于空白對照組，因此RA對細(xì)菌的細(xì)胞膜滲漏有著顯著的影響。RA不僅可以改變細(xì)胞膜的通透性，致使糖類和蛋白質(zhì)滲漏從而影響細(xì)胞的代謝，而且還可以抑制DNA聚合酶的活性從而干擾DNA的復(fù)制[7]。因此對葡萄球菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、糞腸球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌等細(xì)菌有抑制和殺菌功能。RA既能抑制革蘭陽性金黃色葡萄球菌的活性也能抑制大腸埃希菌的活性，有試驗(yàn)表明，當(dāng)RA濃度為0.1 %時(shí)，涂布了大腸埃希菌的平板上沒有抑菌圈產(chǎn)生，而涂布了金黃色葡萄球菌的平板上有直徑為14.7 mm抑菌圈產(chǎn)生；當(dāng)RA濃度達(dá)到0.6 %時(shí)，大腸埃希菌平板上抑菌圈直徑為11.5 mm，金黃色葡萄球菌平板上的抑菌圈直徑為34.2 mm，因此可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對RA更加敏感[8]。另外RA可抑制齲齒鏈球菌、變異鏈球菌的生長和生物膜形成，降低它們的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可用于口腔疾病的預(yù)防、治療。RA的抗微生物功效受pH值與鹽的類型和濃度的影響[9]。

2.1.2抗真菌作用 RA對于不同植物病原真菌菌絲生長有抑制作用，可以有效地減少游動(dòng)孢子的萌發(fā)[10]，但是對病原菌菌絲生長地抑制活性明顯低于對其孢子萌發(fā)地抑制活性，而且由于真菌種類的不同，RA的抑制活性也會(huì)發(fā)生變化。RA的抗菌活性有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，其水溶液在80 ℃水浴30 min或在4 ℃ 貯藏1年其抑菌活性并沒有顯著變化[11]。

2.1.3抗病毒作用 RA是許多植物的活性成分，從46種草本植物中提取了51個(gè)樣品，其中45個(gè)顯示出對MT-4細(xì)胞中HIV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞病變有著顯著的抑制作用[12-13]。RA還能直接抑制逆轉(zhuǎn)錄并影響早期自然內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄的不同階段。RA可以抑制皰疹病毒，其抗病毒活性除抑制病毒生活周期中某些酶活性外，還能迅速與病毒外殼蛋白結(jié)合，從而使皰疹病毒失活；RA在酸性條件下與亞硝酸根離子反應(yīng)得到6-硝基和6，6-二硝基迷迭香酸這兩種化合物，可以作為HIV-1整合酶的抑制劑，并抑制人淋巴細(xì)胞MT-4細(xì)胞中的病毒復(fù)制而不增加細(xì)胞毒性[14]；RA可減少患有日本腦炎病毒的老鼠病死率，顯著降低病毒數(shù)量和促炎癥因子水平，使病毒不易傳播[15]；核苷類似物對治療乙型肝炎病毒(HBV)是有效的，但為了防止多重耐藥性的產(chǎn)生，新的抗HBV藥物的研發(fā)也很有必要，而RA則有這個(gè)潛力，因?yàn)槊缘闼醿啥说膬蓚€(gè)酚羥基和咖啡酸樣結(jié)構(gòu)對于抑制ε-Pol的結(jié)合至關(guān)重要，HBV前基因組RNA的ε(ε)序列與病毒聚合酶(Pol)之間的相互作用是HBV復(fù)制周期中的關(guān)鍵步驟，因此，迷迭香酸可以抑制HBV感染細(xì)胞中HBV的復(fù)制[16]。綜上所述，研究RA的抗病毒作用有著重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣泛的市場需求。

2.2抗氧化作用 迷迭香酸的抗氧化能力比維生素E還要強(qiáng)，而它極強(qiáng)的抗氧化能力要?dú)w功于它清除體內(nèi)自由基的能力和防止氧化損傷的本領(lǐng)[17]。研究顯示，RA可以與不飽和脂肪酸競爭性地與脂質(zhì)過氧基結(jié)合，從而降低脂質(zhì)的過氧化速率；RA也能顯著降低細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)生，并通過抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的活化來幫助恢復(fù)線粒體膜電位；RA還能抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)并減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度來抑制溶酶體的釋放；抑制內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)的低密度脂蛋白的氧化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸的抗氧化作用和它的結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，鄰二酚羥基在其中扮演了重要的角色，并且C3位的共軛雙鍵具有增效作用[18]。RA的抗氧化作用使其成為了化妝品市場的潛力股。

2.3抗炎作用 研究發(fā)現(xiàn)用RA可以用來治療炎癥，對皮膚暴露于佛波酯的小鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)RA介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞的浸潤和髓過氧化物酶活性的抑制，并降低了細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)，血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和炎性蛋白-2信使RNA(mRNA)的表達(dá)。RA可抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和腎小球膨脹，起到抗腎炎的作用；RA可減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肝損傷，降低血漿轉(zhuǎn)氨酶的水平，證明了RA的肝保護(hù)作用是通過清除或降低超氧化物或氧化亞硝酸鹽水平而不是通過抑制TNF-α而產(chǎn)生的[19]；RA能抑制嗜中性粒細(xì)胞羈留和間質(zhì)水腫為特點(diǎn)的肺損傷，起到抗肺炎的作用；RA能抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，有效治療關(guān)節(jié)炎并減少受影響關(guān)節(jié)的數(shù)目，起到抗關(guān)節(jié)炎的作用；RA能夠抑制細(xì)菌斑塊的形成，從而防止慢性牙齦炎，起到抗牙周炎的作用；RA對異位性皮炎又稱異位性濕疹或遺傳過敏性濕疹有緩解作用，起到抗皮炎的作用。

2.4抗腫瘤作用 RA能增加黑色素的含量和酪氨酸酶的表達(dá)，通過激活蛋白酶A(PKA)信號(hào)誘導(dǎo)黑色素生成，黑色素在保護(hù)皮膚，預(yù)防光致癌的過程中起著重要的作用；RA還能通過抑制ERK和Akt的磷酸化來抑制結(jié)腸直腸癌地轉(zhuǎn)移；TNF-α可以激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，而RA能抑制TNF-α 誘導(dǎo)的活性氧(ROS)的產(chǎn)生和NF-κB的活化表達(dá)，導(dǎo)致TNF-α誘導(dǎo)的人白血病U937細(xì)胞凋亡[20]；RA能降低HTA29人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中TPA誘導(dǎo)的炎癥基因環(huán)氧酶-2(COX-2)的產(chǎn)生和啟動(dòng)子活性；RA還抑制TPA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(AP-1)的活性，表明RA可能會(huì)有效地預(yù)防乳腺癌[21]；RA可以降低ROS的水平，同時(shí)增加了GSH的產(chǎn)生，抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解；RA能夠抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控PTEN、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)[22-23]；RA對人多發(fā)性骨髓瘤ARH-77細(xì)胞的增殖也有較為明顯的抑制作用，且在一定范圍內(nèi)，呈時(shí)間和劑量依賴性，其機(jī)制可能是由于RA 上調(diào)了Fas 的表達(dá)，引發(fā)了凋亡的死亡受體通路[24]。綜上所述，RA可以在體外和體內(nèi)有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，起到抗腫瘤的作用[25]。

2.5其他作用 紫蘇葉具有抗抑郁的作用，而RA是其主要活性成分。RA能很好地保護(hù)神經(jīng)元和起到抗抑郁的作用。RA通過增加線粒體膜勢能，抑制caspae-3活性，抗凋亡，也可對腦形成膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)還能抵抗谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[26]，RA可促進(jìn)小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的增殖，推測RA對神經(jīng)系統(tǒng)也有一定的影響。通過對小鼠進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA能減少被強(qiáng)迫游泳的小鼠的不動(dòng)性，從而證實(shí)RA具有一定的抗抑郁作用[27]。

RA體外可抑制人血小板中丙二醛的形成，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.37 nmol/L，顯示RA能夠阻止膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，促進(jìn)纖維蛋白溶解活性起到抗血栓的作用。與此同時(shí)，RA也是黃嘌呤氧化酶的抑制劑，而黃嘌呤氧化酶是人體產(chǎn)生尿酸過程中的關(guān)鍵酶，也是治療痛風(fēng)時(shí)的作用靶點(diǎn)，因此，RA有可能成為治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的特效藥物[28]。

3 小 結(jié)

RA在植物中分布廣泛，對它的提取、分離方法研究得比較清楚，因此比較好獲得。其次迷迭香酸的穩(wěn)定性較好，食鹽和蔗糖對RA穩(wěn)定性的沒有影響；pH和溫度對RA的穩(wěn)定性影響較小。結(jié)果表明，RA更適宜在酸性以及低溫的條件下保存使用；光照對RA的影響較大，故在使用時(shí)應(yīng)盡量避光；Ca2+、Mg2+對RA的穩(wěn)定性影響較大，其他金屬離子對RA影響較小，因此使用時(shí)應(yīng)盡避免與鈣、鎂的接觸。同時(shí)RA也具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗抑郁等多種功能且作用明確，所以RA有著廣闊的應(yīng)用前景和市場價(jià)值。隨著對RA作用機(jī)制的進(jìn)一步研究和對其衍生物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，RA會(huì)在制藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中有更多的貢獻(xiàn)。