米力坎木·哈司木，努爾比亞·玉蘇甫，田 剛

(1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，新疆喀什 844000；2.天津市公安醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300040)

胞漿型磷脂酶A2(CPLA2)家族包含6個(gè)胞內(nèi)酶，其中胞漿型磷脂酶A2γ(cPLA2γ)是 cPLA2家族具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的成員[1-2]。有報(bào)道cPLA2家族的其他成員與結(jié)腸、小腸和肺部腫瘤的發(fā)生有密切的聯(lián)系，特別近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)cPLA2α在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中有一定的作用[3-5]，但cPLA2γ與腫瘤的關(guān)系只處于理論推斷上，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)詳細(xì)的報(bào)道。本研究試圖從cPLA2γ角度探索乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)通路及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響，為遏制此類(lèi)疾病的發(fā)生提供一些有價(jià)值的幫助。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1組織標(biāo)本和細(xì)胞系 乳腺癌患者組來(lái)自新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“本院”)2015年1月至2017年2月手術(shù)切除的139例乳腺癌患者。其對(duì)應(yīng)的乳腺癌旁正常組織標(biāo)本作為對(duì)照組。139例乳腺癌患者的病歷資料經(jīng)住院部病案室查閱，結(jié)合隨訪(fǎng)資料完善基本資料分析。其中乳腺癌患者年齡分布范圍為30～65歲，平均(48.8±4.1)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)符合世界衛(wèi)生組織(WHO)的乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株由本院研究所實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2試劑與儀器 cPLA2γ(圣克魯斯生物技術(shù)公司)；cofilin和p-cofilin(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)生物技術(shù)公司)；p-Akt和p-PKCζ (艾博抗生物技術(shù)公司)；Akt和PKCζ (圣克魯斯生物技術(shù)公司)；StealthTMRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(大連寶生物)；cPLA2γ免疫組化試劑盒(北京中杉生物公司)；兔抗人β-actin多克隆抗體(英杰生命技術(shù)有限公司)。超凈工作臺(tái)(細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用，中國(guó)安泰生物技術(shù)公司)；Olympus IX70倒置顯微鏡(日本 奧林巴斯)；轉(zhuǎn)膜儀(伯樂(lè)生物醫(yī)學(xué)有限公司)；凝膠成像系統(tǒng) (美國(guó)柯達(dá)公司)；Transwell小室(美國(guó)密理博公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用PBS清洗兩次，0.25%胰酶消化，用1 mL完全培養(yǎng)基終止消化后吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，接種到6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準(zhǔn)備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2抑制cPLA2γ的表達(dá)及其檢測(cè) 設(shè)計(jì)3段cPLA2γ靶Stealth siRNA 序列(si#1,si#2 and si#3 siRNA)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)用一段無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)照組(scr表示)，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組。48～72 h后裂解細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)cPLA2γ的表達(dá)情況。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA水平。

1.2.3StealthTM-RNA轉(zhuǎn)染 采用脂質(zhì)體復(fù)合物滴加細(xì)胞表面的方法轉(zhuǎn)染，6 h后換成常用RPMI-1640培養(yǎng)液；細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，取細(xì)胞進(jìn)行下一次轉(zhuǎn)染，細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染兩次后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4免疫組化檢測(cè)cPLA2γ表達(dá) 應(yīng)用免疫組化檢測(cè)臨床乳腺癌標(biāo)本石蠟切片中cPLA2γ蛋白的表達(dá)情況。按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，染色結(jié)果由兩名中級(jí)職稱(chēng)以上病理科醫(yī)生采用雙盲原則評(píng)定。結(jié)果判定胞漿出現(xiàn)淺黃至棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔培養(yǎng)板每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞孵育過(guò)夜，然后用無(wú)菌移液槍頭在培養(yǎng)皿表面劃均勻直線(xiàn)一道。觀(guān)察劃線(xiàn)周邊細(xì)胞移動(dòng)距離，分別測(cè)量3處取均值繪制曲線(xiàn)。

1.2.6Western blot檢測(cè)cofilin、PKCζ及其磷酸化抗體和Akt及其磷酸化抗體的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，向6孔板中加入細(xì)胞裂解液(300 μL/孔，其中PMSF濃度為0.1%)，冰上裂解后用10% SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，分別用cofilin、p-cofilin、PKCζ、p-PKCζ、Akt和p-Akt(ser473和Thr308)的兔抗人單克隆一抗(1∶1 000)室溫下孵育2 h，再用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫下孵育30 min。

1.2.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞挑選抑制cPLA2γ表達(dá)的克隆細(xì)胞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，欲獲得抑制cPLA2γ表達(dá)的MDA-MB-231穩(wěn)定克隆細(xì)胞(用shcPLA2γ MDA-MB-231細(xì)胞表示)，Western blot檢測(cè)挑選的穩(wěn)定克隆細(xì)胞抑制cPLA2γ表達(dá)的效果。shcPLA2γ MDA-MB-231細(xì)胞的cPLA2γ蛋白表達(dá)比scr MDA-MB-231細(xì)胞的明顯降低。

1.2.8體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用免疫缺陷SCID小鼠，均來(lái)自中科院動(dòng)物中心，4～6周齡，雌性，清潔級(jí)；選取經(jīng)過(guò)篩選的scr細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有cPLA2γ shRNA的MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，懸液20 μL以微量注射器注射于小鼠尾靜脈(各10只，分別作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)。注入小鼠腫瘤細(xì)胞后2周觀(guān)察自發(fā)轉(zhuǎn)移和定向轉(zhuǎn)移情況，處死小鼠，取出小鼠的肺，觀(guān)察臟器表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和大小。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測(cè)cPLA2γ在乳腺癌組織中表達(dá) 139例乳腺疾病患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的89例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的50例。在89例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，有80例cPLA2γ表達(dá)陽(yáng)性。然而，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的50例病例中，只有4例cPLA2γ表達(dá)陽(yáng)性。兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。配對(duì)的正常乳腺組織中無(wú)cPLA2γ表達(dá)(圖1)。提示cPLA2γ的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)cPLA2γ的表達(dá)與腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)有關(guān)。

圖1 cPLA2γ在乳腺導(dǎo)管癌組織和乳腺癌旁組織中的表達(dá)(40×)

2.2StealthTM-RNAi技術(shù)分析MDA-MB-231細(xì)胞中cPLA2γ表達(dá)情況

2.2.1抑制cPLA2γ表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染si#1、si#2和si#3 siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞cPLA2γ的蛋白表達(dá)水平明顯比對(duì)照組和scr細(xì)胞的cPLA2γ蛋白表達(dá)水平降低，且si#3 siRNA的效果最明顯。RT-PCR結(jié)果也同樣顯示MDA-MB-231細(xì)胞的cPLA2γ的mRNA表達(dá)水平明顯比對(duì)照組降低。

2.2.2抑制cPLA2γ表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力影響 應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，抑制了cPLA2γ的表達(dá)，細(xì)胞遷移和定向運(yùn)動(dòng)能力明顯比對(duì)照組降低(圖2)。

圖2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞抑制cPLA2γ的表達(dá)抑制細(xì)胞遷移

2.2.3抑制cPLA2γ表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析表明對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞G0/G1期為45.3%±3.1%，S期為34.9%±2.9%，G2/M期為20.8%±1.8%。抑制cPLA2γ表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞G0/G1期為39.0%±3.0%，S期為35.9%±5.7%，G2/M期為25.1%±3.4%。結(jié)果顯示抑制cPLA2γ表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞S期以及G2/M期生長(zhǎng)沒(méi)有受影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞遷移功能的改變不依賴(lài)于細(xì)胞增殖。

2.3cPLA2γ抑制后細(xì)胞侵襲能力變化 計(jì)數(shù)聚碳酸酯膜中央部分和周?chē)糠?個(gè)隨機(jī)視野(200×)內(nèi)侵襲細(xì)胞的數(shù)目，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)Scr細(xì)胞和通過(guò)siRNA抑制PLA2γ(sicPLA2γ)/MDA-MB-231細(xì)胞平均每個(gè)視野侵襲細(xì)胞為243.15個(gè)和50.12個(gè)，sicPLA2γ/MDA-MB-231細(xì)胞穿透matrigel膠的能力明顯低于Scr組，與Scr組相比侵襲能力下降了79.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖3。

圖3 抑制cPLA2γ表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4cPLA2γ調(diào)節(jié)EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)分子Akt、cofilin和PKC磷酸化活性 在sicPLA2γ MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)，EGF刺激5 min內(nèi)，cofilin的磷酸化表達(dá)水平與對(duì)照組相比有明顯下降的趨勢(shì)。Akt在cofilin的信號(hào)通路上游，同時(shí)檢測(cè)了EGF誘導(dǎo)的Akt 473和308位點(diǎn)的磷酸化水平，結(jié)果sicPLA2γ MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Akt 473和308位點(diǎn)的磷酸化蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組明顯降低。另外Akt也是PKC的上游調(diào)節(jié)分子，sicPLA2γ MDA-MB-231細(xì)胞PKC磷酸化活性明顯比對(duì)照細(xì)胞低。提示抑制cPLA2γ表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移降低作用機(jī)制，與PI3K/Akt通路有關(guān)。

2.5抑制cPLA2γ表達(dá)對(duì)SCID鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響 尾靜脈注入shcPLA2γ MDA-MB-231細(xì)胞的SCID小鼠肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯比對(duì)照組注入scr MDA-MB-231細(xì)胞的少。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的cPLA2家族成員之一cPLA2γ具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)已引起學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注。它是唯一鈣離子非依賴(lài)型的膜結(jié)合磷脂酶A，有兩個(gè)保守的模序即C端的異戊烯化和N端的十四烷?；痆5-8]。CAAX的法尼基模序的突變將引起其在胞漿內(nèi)定位的改變。另外cPLA2γ缺乏PLA1的活性，從sn-1和sn-2位脫?；饔冕尫庞退?、花生四烯酸和其他不飽和脂肪酸。其活性功能的潛在上游信號(hào)分子研究的還不十分清楚[9]。但本研究的結(jié)果充分體現(xiàn)cPLA2γ在EGF誘導(dǎo)的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。

應(yīng)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，cPLA2γ在乳腺癌組織浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)率高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析cPLA2γ的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系可見(jiàn)，cPLA2γ的表達(dá)升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在不同的乳腺癌細(xì)胞系中cPLA2γ的表達(dá)(不同于cPLA2其他亞型)是均勻的[10-12]。抑制cPLA2γ表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞不能改變其生長(zhǎng)周期，這些與cPLA2γ功能的獨(dú)特性有關(guān)[13]。所有的研究數(shù)據(jù)表明cPLA2γ在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起非常重要的作用。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，抑制癌基因及其受體的表達(dá)將是切斷腫瘤蔓延生長(zhǎng)的根本。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生的新靶點(diǎn)cPLA2γ將為臨床小分子抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)提供新思路。

以前的文獻(xiàn)曾報(bào)道PKCζ在乳腺癌遷移中起著非常關(guān)鍵的作用[14]。PKCζ的活化通過(guò)PDK1/Akt2/Rictor調(diào)節(jié)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)cPLA2γ調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移是通過(guò)PI3K/Akt通路。EGF誘導(dǎo)的Akt473、Akt308和cofilin的磷酸化水平在抑制cPLA2γ表達(dá)后受到抑制也表明，cPLA2γ可能參與PI3K/Akt通路下游分子的定位和活化。cPLA2γ也可作為抑制腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)集簇應(yīng)答的新靶點(diǎn)。

對(duì)SCID鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響觀(guān)察可見(jiàn)，鼠尾靜脈注射抑制cPLA2γ表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，SCID小鼠肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯比對(duì)照組小鼠少。說(shuō)明抑制cPLA2γ表達(dá)影響了乳腺癌細(xì)胞的被動(dòng)轉(zhuǎn)移和定向轉(zhuǎn)移。臨床上抑制腫瘤細(xì)胞的目的是延長(zhǎng)患者生存期，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步闡明cPLA2γ表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，預(yù)示其可作為患者生存期延長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。

4 結(jié) 論

cPLA2γ參與EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。抑制cPLA2γ表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移起著抑制作用。本研究為進(jìn)一步闡明乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新思路，cPLA2γ的調(diào)控與Akt通路有關(guān)。Akt信號(hào)通路中的靶分子cPLA2γ可能成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。