周笑伶,曹 勤 綜述,王生余△ 審校

(1.江蘇省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210017；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210017)

宮頸癌發(fā)病率位居全球女性惡性腫瘤第二位，每年因?qū)m頸癌死亡人數(shù)達(dá)27萬人，占女性腫瘤病死率的首位(其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家)，并以每年50萬新增病例的速度增長[1]。研究發(fā)現(xiàn)，99.7%的宮頸癌患者存在人乳頭瘤病毒(HPV)感染[2]，且HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌前病變和浸潤癌的必要因素[3]。

HPV是一種長度為50～55 nm，無包膜的小分子雙鏈DNA病毒，HPV僅編碼八個基因，包含支持病毒DNA復(fù)制的6個早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和編碼病毒組裝與釋放所必需衣殼蛋白的2個晚期基因(L1、L2)。病毒編碼的癌基因不會導(dǎo)致宿主細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化，但會誘導(dǎo)免疫逃逸和異常細(xì)胞增殖使基因組結(jié)構(gòu)畸變和突變[4]。按照潛在致癌性，通常將HPV病毒分為低危型和高危型，高危型HPV的持續(xù)感染可引起宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌[5]。事實(shí)上，90%的宮頸癌可以通過早期檢查得以治愈，美國因及時篩查出早期癌前病變并治療，使得宮頸癌發(fā)病率和病死率下降了60%[6]，而發(fā)展中國家缺乏定期的健康檢查和正規(guī)的醫(yī)療保健體系，往往錯過了宮頸癌的早期診斷，病死率是美國的50倍[5]。因此，亟待推行一個快速、低成本的人口水平篩查和監(jiān)測的方法，來降低宮頸癌的發(fā)病率，提高人民健康水平。

巴氏染色宮頸細(xì)胞學(xué)涂片檢查是已知最早的宮頸癌篩查標(biāo)準(zhǔn)，自20世紀(jì)50年代引入臨床，使55歲以下宮頸癌病死率下降60%[7]。到了90年代，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)取代了巴氏涂片檢查，使高分化鱗癌檢測靈敏度提高1.29倍，但對于細(xì)胞學(xué)結(jié)果的解釋不僅與相關(guān)人員的經(jīng)驗(yàn)和水平相關(guān)，而且對于血液模糊、炎癥干擾、固定不良、細(xì)胞溶解或細(xì)胞不足(<5 000個可見的液基細(xì)胞)的樣本，或是有爭議的細(xì)胞涂片，如非典型的意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞、不能排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞和非典型腺體細(xì)胞，則需要進(jìn)行分子學(xué)檢測以得到更明確的診斷[8]。HPV檢測被FDA(美國食品藥品監(jiān)督管理局)批準(zhǔn)用于對宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常的患者進(jìn)行后續(xù)檢測，以避免不必要的陰道鏡檢查。

1 人乳頭瘤病毒主要檢測方法

1.1第二代雜交捕獲法(HC2)檢測HPV-DNA HC2檢測法由Digene公司開發(fā)，并于1999年被FDA批準(zhǔn)，其實(shí)質(zhì)是分子雜交信號放大技術(shù)。該檢測方法采用能檢測出13種高危型HPV的多基因RNA探針，捕獲結(jié)合后的雜合體至包被有單克隆抗體的板孔上，最后借助信號放大和化學(xué)發(fā)光技術(shù)完成基因水平檢測。

臨床研究表明，HC2檢測法可指示高危型HPV-DNA的存在，且對高度組織病變具有高靈敏度，比宮頸細(xì)胞學(xué)檢查更易發(fā)現(xiàn)高度病變?nèi)巳篬9]。但是，該方法無法區(qū)分特定的HPV基因型，不包含內(nèi)部對照，且探針使用時，存在堿基對錯配、探針混合物與非靶向的高危和低危的HPV6、11、26、30、40、42、53、54、61、67、70、73、81、83、84、87和91交叉反應(yīng)等問題[10]。

1.2酶切信號擴(kuò)大法(Cervista HPV-HR)檢測HPV-DNA Cervista HPV-HR檢測法由Third Wave Technologies公司開發(fā)，并于2009年被FDA批準(zhǔn)?；趯＠鸌nvader信號放大化學(xué)發(fā)光技術(shù)，該方法在等溫反應(yīng)環(huán)境下，借助Cleavase酶特異識別、切割目標(biāo)DNA分子結(jié)構(gòu)，并利用能檢測出L1，E6和E7基因序列的特異探針完成對14種高危型HPV-DNA的識別、檢測。與HC2檢測相比，該方法具有樣本量少，包含內(nèi)、外部對照，交叉反應(yīng)較低等優(yōu)點(diǎn)，但仍不能進(jìn)行單個基因分型[10]。

1.3實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(Cobas 4800)檢測HPV-DNA Cobas 4800 HPV檢測法由Roche Molecular Diagnostics公司開發(fā)，并于2011年被FDA批準(zhǔn)。該檢測采用多重實(shí)時PCR和與4種熒光報(bào)告探針進(jìn)行的核酸雜交技術(shù)，完成對14種高危型HPV的L1基因的核苷酸序列的同時檢測。實(shí)驗(yàn)使用β-珠蛋白作為提取和擴(kuò)增的內(nèi)部對照，外部設(shè)有陰、陽性對照來保證運(yùn)行質(zhì)量。該系統(tǒng)由兩個獨(dú)立的儀器組成，包括用于自動化核酸提取的Cobas z480儀器和用于在單個管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測反應(yīng)的Cobas x480分析儀?？梢詸z測14種高危型HPV并對HPV16和HPV18進(jìn)行單獨(dú)的基因分型。與HC2法相比，Cobas 4800試驗(yàn)具有與HC2相當(dāng)?shù)呐R床敏感性，并且由于與低風(fēng)險(xiǎn)HPV基因型的交叉反應(yīng)水平較低[11]，特異度提高。但也可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因?yàn)長1基因在大量癌癥中整合到人類基因組中時會丟失，在這種情況下，僅檢測L1基因的HPV測試系統(tǒng)就可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果[12]。

1.4逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法(Aptima HPV)檢測E6/E7 mRNA Aptima HPV檢測法由Hologic Gen-Probe公司開發(fā)，并于2012年被FDA批準(zhǔn)。該方法通過檢測高危型HPV E6/E7癌基因mRNA間接測定HPV-DNA含量。研究表明，病毒癌基因E6和E7能促進(jìn)被感染細(xì)胞中的腫瘤抑制基因p53降解，并改變調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)的活性，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，盡管E6和E7基因表達(dá)量少，但其過表達(dá)可能與疾病進(jìn)展直接相關(guān)。Aptima HPV檢測法可檢測14種高危HPV類型的E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄物，而且不與低危型HPV(HPV6、11、42、43、44、53、61、71和81)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有相當(dāng)高的分析靈敏度，但仍不區(qū)分HPV類型[13]。

此外，上述方法需要高度專業(yè)化和體積龐大的儀器用于樣品預(yù)處理和后續(xù)檢測，例如Cobas HPV系統(tǒng)重量超過150 kg，寬度為166 cm，而Cervista HPV HR檢測系統(tǒng)重量約363 kg，高度超過175 cm，并且PCR擴(kuò)增過程中對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求也特別嚴(yán)格，通常要求檢測設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置要求并通過國家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證，同時檢測人員須通過臨檢中心培訓(xùn)并取得合格證書，操作環(huán)境保證無菌無塵。這些對于基礎(chǔ)設(shè)施比較差的發(fā)展中國家，尤其是一些偏遠(yuǎn)的基層醫(yī)院是難以實(shí)現(xiàn)的，因此，能夠分離和檢測核酸生物標(biāo)志物的簡單且有效的整合平臺仍然是醫(yī)學(xué)診斷中的重要需求。

1.5核酸篩選的最新發(fā)展——微流控芯片技術(shù) 近年來，隨著PCR擴(kuò)增技術(shù)及微流控技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們開發(fā)了一個能集成樣品裝載、細(xì)胞溶解、擴(kuò)增及檢測于一體的微流控芯片，并將該芯片成功地應(yīng)用于HPV-DNA的檢測[14]。與上述幾種傳統(tǒng)的方法相比，該芯片具有靈活，體積小巧，便于移動，可自動操作等特點(diǎn)，可為不同的樣本提供標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理單元，從而消除了因離心、混合和凍融步驟所導(dǎo)致的場地問題，甚至是PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)化問題。此外，該芯片還可以避免樣品多步處理過程中出現(xiàn)內(nèi)源性核糖核酸酶激活、不適pH值和溫度，從而導(dǎo)致的樣品降解[15]。大量研究表明，這種能快速分離出病毒DNA，并在最小化人為干預(yù)的情況下，將其傳送到檢測裝置傳感器的封閉集成單元內(nèi)的微流控系統(tǒng)是目前HPV檢測的最佳選擇。

一般來說，用于制作微流控芯片的材料主要包括：晶體硅、玻璃、石英、塑料和高分子聚合物等。其中，高分子聚合物(如聚甲基丙酸甲酯PMMA，聚苯乙烯PS等)由于具有加工方便、成本低、易批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于微流控芯片制造。微流控芯片制作的方法包括機(jī)械加工法、刻蝕法和模具法。其中，模具法由于具有低成本、快速成型、良好的光學(xué)性能和絕熱絕緣性能、易于封裝等特點(diǎn)，被廣泛使用于微流控芯片加工[16]。圖1A為Rheonix公司制作的用于HPV DNA檢測的微流控芯片，每個芯片由4個微流控通道陣列而成，可同時對4個樣本進(jìn)行全自動化檢測。該芯片由1.0 mm厚的含有不連續(xù)通道的聚苯乙烯層和38 μm柔性聚苯乙烯層通過弱溶劑層壓法壓制而成。不連續(xù)通道間包含一組隔膜袋，并與安裝在其上的聚苯乙烯層結(jié)合，構(gòu)成圖1B所示的泵/閥裝置。實(shí)驗(yàn)中，對隔膜袋中的孔施加正壓，聚苯乙烯柔性層被向上推動，不連續(xù)通道斷開，完成閥門關(guān)閉，流體流動阻斷；對隔膜袋中的孔施加負(fù)壓，聚苯乙烯柔性層被拉入隔膜袋中，不連續(xù)通道連通，完成閥門開啟，流體在毛細(xì)作用下流動。依此規(guī)律，串聯(lián)的多個隔膜袋中的孔內(nèi)壓力可依據(jù)設(shè)計(jì)的控制程序完成規(guī)律性變化，最終實(shí)現(xiàn)流體單/雙向流動控制，這為液體混合提供附加的通用性和有效性[17]。

A:微流控陣列;B:泵/閥裝置

圖1RheonixQuadCARD芯片外形

目前，基于微流控平臺，發(fā)展了許多用于生物分析的相關(guān)技術(shù)，如細(xì)胞分析[18]，核酸分析[19]，蛋白質(zhì)工程[20]，突變檢測[21]，床旁檢測[22]等。KASAMA等[23]開發(fā)了基于聚苯乙烯微珠的微流體免疫吸附測定系統(tǒng)，用于分析人類免疫球蛋白A，使樣品體積縮小至微升范圍，抗原-抗體反應(yīng)時間從15 h縮短至10 min。ZHANG等[24]集成了微流控和微珠陣列技術(shù)，開發(fā)了檢測血清提取物中HBV基因型的敏感片上病毒DNA分析方法。作者指出若使用TAMRA作為標(biāo)記，試管法只能在0.1 nmol/L的靶DNA濃度下產(chǎn)生明顯的熒光信號，而芯片病毒基因分型可區(qū)分0.03 nmol/L的靶DNA；若使用量子點(diǎn)作為標(biāo)記，芯片法甚至可檢測到4pM的靶DNA。與傳統(tǒng)的平面DNA芯片(通常>1 h)相比，微流控芯片提供了更高的分析靈敏度和更短的反應(yīng)時間(<30 min)。

2 微流控芯片技術(shù)方法

微流控芯片法基本過程包括核酸提取、PCR擴(kuò)增和反向斑點(diǎn)雜交。

2.1核酸提取 將待測樣本加入芯片加樣孔，在微泵驅(qū)動下，利用磁珠分離技術(shù)，即在通道內(nèi)磁性、界面和黏性阻力的作用下，樣本與靶物質(zhì)結(jié)合，從而快速高效地提取細(xì)胞DNA，同時很好地避免了人工提取過程中產(chǎn)生的污染和誤差。ZHANG等[25]開發(fā)了一種3D打印微流控芯片，并用實(shí)時q-PCR結(jié)果證明，其可以利用磁性運(yùn)動，通過水油界面屏障來過濾樣本污染物并提純目的核酸，稱該芯片能在15 min內(nèi)高效提取HPV18質(zhì)粒，且提取效率達(dá)到61%(HPV質(zhì)粒濃度為5×10至5×106copy/100 μL)，可以在大范圍HPV質(zhì)粒濃度下實(shí)現(xiàn)較高萃取率。該過程保證了高純度的目的DNA檢測的準(zhǔn)確度，是微流控芯片技術(shù)向著自動化和微型化發(fā)展的前提保障[26]。

2.2PCR擴(kuò)增 針對HPV基因組設(shè)計(jì)特異度引物，對目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出24種HPV基因型的目的片段，即可同時檢測出18種高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83)和6種低危型HPV(HPV6、11、42、43、44、81)。

2.3反向斑點(diǎn)雜交(RDB) 將針對HPV基因組設(shè)計(jì)的24種亞型的探針包被在芯片檢測區(qū)雜交膜上，若擴(kuò)增產(chǎn)物中含有目的基因，則可被芯片上的探針捕獲，經(jīng)酶和顯色液作用后可判斷出感染人乳頭瘤病毒核酸及感染的亞型。不同于傳統(tǒng)固定靶DNA一次只能檢測一種核酸型的雜交方式，包被探針再與目的DNA雜交的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時檢測多種基因型的需要，使得檢測更加快速高效。與HC2相比，雖然兩種方法在HPV陽性檢出率上趨于一致，但RDB在反映檢測方法準(zhǔn)確性的Yondon指數(shù)時更敏感[27]，而且檢測成本更加低廉。

3 微流控芯片技術(shù)在HPV-DNA檢測中的應(yīng)用

微流控芯片系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了自動取樣、核酸純化、擴(kuò)增和檢測于一體，且具有靈敏度高、檢測速度快、易于微型化、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已被開發(fā)用于HPV-DNA的檢測并得到了很好的結(jié)果。TASOGLU等[1]設(shè)計(jì)的微流控芯片，與傳統(tǒng)的核酸序列擴(kuò)增相比，擴(kuò)增至相同的熒光水平下，芯片法只需要1/2 000的樣本量。YUE等[18]構(gòu)建了一種基于微流控和微珠陣列集成的多路復(fù)用生物分析敏感平臺，并采用該平臺平行檢測和區(qū)分了4種HPV基因型，同時鑒定了6種蛋白質(zhì)標(biāo)記物。研究結(jié)果表明該芯片可以檢測出25 pmol/L帶有特異度序列的目的DNA，在芯片外檢測中，需要靶DNA濃度達(dá)到360 pmol/L以至于信噪比(SNR)>3。此外，該平臺與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)相比，具有試劑消耗少、樣品注射簡單、標(biāo)本污染少和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。ZHANG等[28]開發(fā)了一種基于微流體裝置和微珠陣列的檢測HPV基因型的方法。研究結(jié)果表明，該方法能分辨低至1 fmol/L (10 zmol/chip,SNR>3) 的HPV寡核苷酸DNA，且信號放大后使得芯片檢測靈敏度是芯片外的1 000倍。作者還指出該方法還可以對10 copy/μL 的HPV基因組DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分辨和基因分型，檢測范圍從1 copy/μL至1×105copy/μL。

微流控系統(tǒng)的出現(xiàn)還為HPV細(xì)胞的收集和即時檢測提供了條件，BONK等[29]研究出了適用于微流控癌癥篩選裝置的模型，通過將與HPV感染相關(guān)的跨膜蛋白α6整合素的抗蛋白抗體涂覆于微通道表面，在微通道16～20 μL/min流速范圍內(nèi)，正常細(xì)胞被洗脫而HPV感染細(xì)胞被保留，可收集這些病理細(xì)胞用于后續(xù)檢測。HWANG[30]在研究中指出，使用基于微流控技術(shù)發(fā)展起來的即時檢測(POCT)技術(shù)，檢測HPV16-DNA在樣本中的表達(dá)，結(jié)果與常規(guī)RQ-PCR方法一致(Kappa=1)，因?yàn)槭÷粤朔蛛x和顯色步驟，使臨床樣本實(shí)現(xiàn)即時檢測成為可能。

4 小 結(jié)

微流控芯片技術(shù)在HPV檢測中主要有兩種用途：(1)用于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常的患者。如存在非典型的意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞、不能排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞和非典型腺體細(xì)胞的患者篩查，需要進(jìn)行分子學(xué)檢測以得到更明確的診斷，以確定是否需要進(jìn)行陰道鏡檢查。(2)對易感女性進(jìn)行病毒檢測及風(fēng)險(xiǎn)評估，為臨床醫(yī)生制定合理的治療方案提供依據(jù)。

微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，為癌癥篩查、早期診斷、自我保健、疫苗接種和手術(shù)后監(jiān)測提供了依據(jù)。因其在基因診斷方面的巨大潛力，此項(xiàng)技術(shù)也一定會更多應(yīng)用到其他疾病相關(guān)分子水平的檢測中，如傳染病、腫瘤、對過敏原的免疫應(yīng)答、免疫療法和化療等，成為更多疾病探尋致病機(jī)理和核酸分析的手段。