何義 林飛 潘靈輝 杜學(xué)柯 葛萬(wàn)運(yùn) 王甜甜 肖靖遠(yuǎn)

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科（南寧530021）

肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肺組織經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的缺血后，再恢復(fù)血流供應(yīng)時(shí)觸發(fā)一系列復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致肺損傷進(jìn)一步加重的病理過(guò)程。臨床上常發(fā)生于肺移植、體外循環(huán)、肺的袖式切除、創(chuàng)傷、心肺復(fù)蘇等［1-2］。程序性細(xì)胞死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）作為一種免疫抑制受體能通過(guò)調(diào)控T 細(xì)胞的數(shù)量、功能、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、免疫逃逸等免疫反應(yīng)在腫瘤、自身免疫性疾病、慢性病毒感染等多種疾病中發(fā)揮重要作用。有研究［3-4］證實(shí)PD-1參與了巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程。研究［5-6］表明，PD-1在腸、肝等器官的缺血再灌注損傷中都發(fā)揮重要作用。但是，PD-1是否參與LIRI尚未明確。本研究通過(guò)建立大鼠肺缺血再灌注的動(dòng)物模型，期望探討PD-1在LIRI 中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0003。

1.1.2 主要試劑 PD-1 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；β-actin 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；辣根酶標(biāo)記驢抗山羊IgG（碧云天公司）；大鼠IL-1β ELISA KIT（武漢華美）；大鼠IL-4 ELISA KIT（武漢華美）；大鼠IL-6 ELISA KIT（武漢華美）；大鼠IL-10 ELISA KIT（武漢華美）；Rabbit Anti-CD11c antibody（北京博奧森）；Rabbit Anti-CD16 antibody（北京博奧森）；Rabbit Anti-Macrophage mannose receptor 1 antibody（北京博奧森）；Rabbit Anti-Arginase 1 antibody（北京博奧森）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將所有大鼠隨機(jī)分成5 個(gè)組，分別是對(duì)照組、再灌注2 h 組、再灌注6 h組、再灌注24 h 組、再灌注72 h 組。大鼠10%水合氯醛0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)口插入氣管導(dǎo)管，固定氣管導(dǎo)管，接動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸（呼吸頻率60 次/min，潮氣量10 mL/kg，吸呼比1∶1，F(xiàn)iO2100%）。左胸前備皮消毒，沿第四肋間開胸，暴露肺門，以無(wú)損傷血管夾夾閉肺門1 h 后，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)供血和通氣并逐層關(guān)胸，分別于2、6、24、72 h 后心臟取血處死動(dòng)物［7］。大鼠正中開胸，暴露右心室，緩慢經(jīng)右心室注入50 mL PBS 進(jìn)行灌洗左肺直至發(fā)白，完畢后獲取左肺組織，待檢。

1.2.2 HE 染色觀察肺損傷程度 肺組織置于4%的多聚甲醛固定，濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5～8 μm 的切片置于載玻片上，貼片后進(jìn)行HE 染色，在光鏡下觀察肺損傷程度，并進(jìn)行肺損傷評(píng)分。

1.2.3 電鏡觀察肺組織的超微結(jié)構(gòu) 將肺組織標(biāo)本切成約1 mm 的小塊，固定在3%的戊二醛中至少2 h 后，放在1%的鋨酸中至少1～2 h，然后在不同濃度丙酮中進(jìn)行脫水，再放入樹脂中。樣品用超薄切片切割成超薄切片。使用H-760 透射電子顯微鏡（H-760，東京，日本）觀察超薄切片。

1.2.4 肺濕重/干重（W/D）比值檢測(cè)肺水腫 取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左肺組織，置于濾紙上吸干組織表面液體后稱重，記為濕重（W），之后將肺組織置于60 ℃烤箱96 h 至恒重，稱重記為干重（D），肺組織濕重與干重的比值即為肺組織的干濕比（W/D）。

1.2.5 ELISA 法測(cè)IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 取各組肺組織標(biāo)本，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 的表達(dá)水平。

1.2.6 Western Blot法檢測(cè)肺組織PD-1蛋白表達(dá)參照SUN 等［8］的方法進(jìn)行，使用RIPA 裂解液并加入磷酸酶抑制劑提取肺組織中的蛋白，用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度后，置于-80 ℃冰箱保存。制10%的聚丙烯酰胺凝膠加樣電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%的BSA 封閉2 h。PVDF 膜放在配制好的PD-1（1∶125），β-actin（1∶1 000）抗體中4 ℃過(guò)夜孵育。洗膜后置于1∶1 000 稀釋的二抗中室溫孵育1 h 之后用ECL 顯影劑顯影，經(jīng)過(guò)電腦掃描成像。

1.2.7 免疫組化法測(cè)肺組織CD11c、CD16、CD206、Arg1 的表達(dá) 常規(guī)石蠟包埋并切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸法高壓修復(fù)抗原；分別加入CD11c、CD16、CD206、Arg1 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育10 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育10 min；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察染色情況。按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，深棕色或棕褐色為3 分。按陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜10%為0 分，10%～25%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分。以上述兩項(xiàng)評(píng)分乘積記為免疫組化評(píng)分，選5 個(gè)視野觀察評(píng)分取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化 對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔均勻一致，無(wú)間質(zhì)充血，肺泡內(nèi)腔未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組比較，缺血再灌注各組肺組織結(jié)構(gòu)不同程度破環(huán)，再灌注2 h 組肺泡壁輕度增厚，肺間質(zhì)水腫，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；再灌注6 h 組損傷最嚴(yán)重，肺泡間隔不一，肺間質(zhì)明顯水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；隨后肺損傷程度逐漸降低。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組肺損傷評(píng)分均上升（均P＜0.05）；其中，再灌注6 h 組肺損傷評(píng)分明顯高于其他組。見圖1。

圖1 肺組織病理學(xué)變化（×100）及肺損傷評(píng)分Fig.1 Histopathology results of rat lung tissues and the score of lung injury（×100）

2.2 肺組織超微結(jié)構(gòu)變化 對(duì)照組肺組織超微結(jié)構(gòu)正常，可見完整的基底膜和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的微絨毛和板層小體明顯。缺血再灌注各組肺組織微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損壞，再灌注2 h 組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的微絨毛開始減少，再灌注6 h 組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞微絨毛變得光滑且數(shù)目顯著減少，板層小體稀少。再灌注72 h 組損傷減輕。見圖2。

圖2 肺組織超微結(jié)構(gòu)變化（×10 000）Fig.2 The ultrastructural changes of lung tissues（×10 000）

2.3 W/D 值比較 與對(duì)照組比較，缺血再灌注各組W/D 值均增大（P＜0.05）；其中，再灌注6 h 組顯著增大，肺水腫最嚴(yán)重。見圖3。

2.4 肺組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 表達(dá)比較與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組IL-1β（A）、IL-6（B）、IL-4（C）、IL-10（D）水平增高（P＜0.05）；其中，IL-1β、IL-6、IL-10 在再灌注6 h 組達(dá)到高峰，IL-4 水平在再灌注24 h 組表達(dá)最高。見圖4。

圖3 肺組織W/DFig.3 The ratio of wet-to-dry in lung tissue

2.5 肺組織PD-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組相比，再灌注各組PD-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均增高（P＜0.05），其中再灌注6 h 組表達(dá)最高。見圖5。

2.6 肺組織CD11c、CD16、CD206、Arg1 的表達(dá)通過(guò)檢測(cè)表面標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)探討巨噬細(xì)胞極化是否與此相關(guān)，CD11c、CD16 是巨噬細(xì)胞M1 方向極化的表面標(biāo)記物，CD206、Arg1 為M2 方向極化的表面標(biāo)志物。與對(duì)照組比，再灌注6 h 組CD11c、CD16、CD206、Arg1 均表達(dá)增高（P＜0.05）。與再灌 注6 h 組 比 較，再 灌 注72 h 組CD11c、CD16、CD206、Arg1 均表達(dá)減少（P＜0.05）。見圖6、7。

圖4 肺組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 表達(dá)Fig.4 The changes of IL-1β，IL-4，IL-6 and IL-10 level in lung tissues at different time points

圖5 肺組織PD-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The changes of PD-1 expression in lung tissues（Western Blot）

3 討論

圖6 肺組織CD11c、CD16、CD206、Arg1 的表達(dá)（×100）Fig.6 The expression of CD11c，CD16，CD206 and Arg1 in lung tissues（×100）

圖7 肺組織免疫組化評(píng)分Fig.7 The score of immunohistochemical in lung tissues

LIRI 是術(shù)后早期呼吸功能障礙的重要原因，嚴(yán)重的缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的原發(fā)性移植物功能障礙是引起肺移植術(shù)后死亡的主要原因［9］。其特征性改變?yōu)榉嗡[、微血管通透性增加、肺血管阻力增加、及肺動(dòng)脈高壓等。研究表明［10］，它的發(fā)生與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、促炎介質(zhì)釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞活化、細(xì)胞表面黏附分子上調(diào)、蛋白酶釋放及保護(hù)性介質(zhì)如肺泡表面活性物質(zhì)和NO 減少等因素相關(guān)。炎癥反應(yīng)中，肺泡巨噬細(xì)胞分泌大量炎性細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用，如IL-1β、IL-6 等可進(jìn)一步激活中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并產(chǎn)生氧自由基、NO，促進(jìn)炎癥加重?fù)p傷；而IL-10能減少TNF-α和IL-1β等炎性介質(zhì)的釋放，對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的過(guò)度炎癥反應(yīng)有抑制作用［11］。本研究通過(guò)血管夾完全夾閉左側(cè)肺門1 h 后松開再灌注造模，從HE 染色和電鏡觀察可見再灌注2 h 組開始出現(xiàn)肺水腫，間質(zhì)增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肺損傷的程度隨時(shí)間的推移產(chǎn)生變化：在再灌注6 h 組可見浸潤(rùn)嚴(yán)重，間質(zhì)明顯增厚；再灌注24 h 組損傷緩解，但仍可見浸潤(rùn)；再灌注72 h 組損傷進(jìn)一步減輕。同時(shí)，檢測(cè)的炎癥因子表達(dá)趨勢(shì)也與肺損傷變化趨勢(shì)相契合：IL-1β和IL-6 在再灌注6 h 組達(dá)到高峰，此時(shí)肺損傷也最嚴(yán)重，且IL-6 在再灌注24 h 組和72 h 組仍有高水平表達(dá)，提示此時(shí)促炎反應(yīng)仍未完全消退；而IL-4、IL-10 在再灌注2 h 組開始升高，6 h 組高水平表達(dá)提示隨著炎癥進(jìn)展，機(jī)體產(chǎn)生更多的抑炎因子抵抗促炎反應(yīng)；隨著IL-4、IL-10 的增多，IL-1β和IL-6 產(chǎn)生減少，肺損傷程度相對(duì)應(yīng)減輕。

成熟巨噬細(xì)胞出現(xiàn)功能和表型分化的現(xiàn)象，稱之為極化，按照其分泌的細(xì)胞因子以及表型的不同可分為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（M1 型）和選擇性活化巨噬細(xì)胞（M2 型）兩類。M1 型巨噬細(xì)胞分泌IL-6 等，其表面高表達(dá)CD11c、CD16，主要特點(diǎn)是促進(jìn)炎癥，參與正向免疫調(diào)節(jié)。M2 型巨噬細(xì)胞分泌IL-10 等，表面高表達(dá)CD206、Arg1，主要在抗炎、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和纖維變性及體液細(xì)胞免疫過(guò)程中發(fā)揮作用［12-14］。免疫組化觀察可見肺組織中CD11c、CD16 在再灌注6 h 組表達(dá)增加，可知此時(shí)主要分泌促炎因子的M1 型巨噬細(xì)胞增多，導(dǎo)致肺炎癥加重，損傷嚴(yán)重。同時(shí)CD206、Arg1 表達(dá)也增加說(shuō)明隨著損傷程度加重，M2 型巨噬細(xì)胞開始啟動(dòng)修復(fù)作用。

PD-1 是B7/CD28 超家族的共抑制成員，其在T和B 淋巴細(xì)胞上表達(dá)。研究表明其在一些病毒和細(xì)菌感染中發(fā)揮作用［15-17］。ZHANG 等［5］研究表明，CD4（+）T 細(xì)胞上的PD-1 表達(dá)變化參與腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。JI 等［6］研究表明，PD-1通過(guò)抑制T 細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞功能來(lái)改善肝缺血再灌注損傷。本研究中，PD-1的蛋白相對(duì)表達(dá)量在再灌注2 h 組增高，72 h 組表達(dá)降低，其趨勢(shì)與肺損傷變化相同。YAO 等［3］證實(shí)PD-1 在脊髓損傷中參與了巨噬細(xì)胞極化過(guò)程。YUAN 等［18］證明PD-1 通過(guò)調(diào)節(jié)纖維蛋白原樣蛋白2 來(lái)減弱巨噬細(xì)胞活化和腦炎癥。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-1 影響大鼠肺缺血再灌注損傷變化，其作用機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，PD-1 可能通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化參與的炎癥反應(yīng)來(lái)影響肺缺血再灌注損傷的變化。