杭月 林昌岫 黃成日

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2中心實(shí)驗(yàn)室（吉林延吉133000）

神經(jīng)鞘磷脂（sphingomyelin，SM）是脂質(zhì)筏的重要成分［1］，有希望成為腫瘤診斷和治療的新靶標(biāo)。神經(jīng)鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）是SM 合成的最后一個酶，包含SMS1 和SMS2兩個同工酶。SMS1 參與SM 的生物合成，而SMS2與SM 合成后的加工修飾有關(guān)，是影響細(xì)胞內(nèi)SM、神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）等細(xì)胞因子活性和濃度的關(guān)鍵酶，同時也是炎癥反應(yīng)中重要的調(diào)控因子［2］。由于有研究證實(shí)，SMS1 缺失后對癌細(xì)胞的影響作用并不明顯，所以選擇性的SMS1 抑制劑并不能作為理想的細(xì)胞毒性藥物用于臨床［3］。而下調(diào)SMS2 的表達(dá)可影響脂質(zhì)筏的功能，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡［4］。另外，已知腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）可通過激活酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）降解SM 而生成Cer，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。為進(jìn)一步證明SMS2 與腫瘤細(xì)胞亡的關(guān)系，筆者擬以人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用TNF-α誘導(dǎo)凋亡后，將SMS2 siRNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，探討SMS2 基因沉默后對MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響，從而為臨床治療和藥物研發(fā)提供潛在的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 由延邊大學(xué)病理學(xué)教研室提供并傳代保存。將MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 將對數(shù)期生長的MCF-7 細(xì)胞（1×104/孔）單層接種至96 孔板中，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，加入不同梯度濃度的TNF-α（50、100、200、400、800 ng/mL），孵育48 h 后，每孔加入20 μL MTT，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄除上清液，每孔加入200 μL DMSO，置于振蕩器上震蕩5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結(jié)晶物。將96 孔板放置于酶標(biāo)儀上，檢測波長為570 nm 處的光密度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和IC50：增殖抑制率（%）=1-OD值（受試孔）/OD值（對照空）×100%，每組取8 個復(fù)孔平均值。

重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，取IC50濃度的TNF-α分別作用于細(xì)胞24、48、72、96 h，檢測波長為570 nm 處的光密度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3 構(gòu)建SMS2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 用DEPC水稀釋SMS2 siRNA 至終濃度為20 μmol/L。取適量的SMS2 siRNA 加入至Opti-MEM 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕輕混勻。再取適量的LipofectamineTM2000 與之混合，室溫下孵育約20 min，形成siRNA-LipofectamineTM2000 復(fù)合體。于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光染色判斷感染率。提前1 d 在相應(yīng)備行轉(zhuǎn)染的6 孔板上接種5 × 105個細(xì)胞，加入不含F(xiàn)BS 和雙抗的培養(yǎng)基400 mL 至培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)3 h，隨后加入10%FBS 和TNF-α（終濃度IC50）培養(yǎng)24 h 后，待融合率達(dá)到50%～60%時，再加入適量脂質(zhì)體復(fù)合體，使SMS2 siRNA 終濃度為100 nmol/L。置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。提取細(xì)胞RNA 及蛋白，驗(yàn)證目的基因表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分為4 組：空白對照組（CTL 組）、TNF-α組、陰性對照組（SiR-Con 組）和轉(zhuǎn)染組（SiR2 組）。

1.4 酶活性檢測 收集對數(shù)期生長的MCF-7 細(xì)胞（1 × 107個），加入勻漿液置于冰浴中，取出勻漿粗酶液100 μL 加入SMS 反應(yīng)體系（取100 μL 粗酶液、60 mL 勻漿液、425 μL 雙蒸水、3 μL PC、2 μL NBD-Cer，37 ℃反應(yīng)5 h）中，37 ℃反應(yīng)5 h，加入900 μL 氯仿-甲醇（2∶1）溶液，充分震蕩混勻后，離心并提取有機(jī)相，氮?dú)飧稍铮帽訉游龇ǎ╰hin layer chromatography，TLC）測定SMS 酶活性。

1.5 Hoechst33258/PI 雙染法觀察活細(xì)胞狀態(tài)將各組細(xì)胞（1 × 104個/孔）單層接種至24 孔板中正常培養(yǎng)，每組設(shè)置8 個平行孔，加入預(yù)冷的PBS洗滌3 次，每孔加入濃度為5 μg/mL 的Hoechst 33258 染液200 μL，37 ℃避光孵育15 min，隨后每孔加入濃度為15 μg/mL 的PI 染液50 μL，4℃避光孵育15 min，采用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次后，3 000 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清；加入500 μL Binding Buffer重懸，加入Annexin V 5 μL，避光孵育15 min；加入PI 5 μL，4 ℃避光孵育15 min；3 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清；加入300 μL 結(jié)合緩沖液；上機(jī)檢測。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。采用流式細(xì)胞儀（Ex=488 nm，Em=530 nm）檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 熒光定量實(shí)時PCR （1）采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA；按照RNA 提取試劑盒說明書提供的步驟進(jìn)行操作，采用分光光度計(jì)檢測RNA 濃度。（2）以細(xì)胞cDNA 為模板，以β-actin 作為內(nèi)參。將10 μL 反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫水浴20 min，85 ℃5 s，將反應(yīng)生成的cDNA 放于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?）冰浴中配制20 μL PCR 反應(yīng)體系，95 ℃30 s 預(yù)變性，95 ℃5 s 退火，60 ℃20 s 延伸，循環(huán)40 次，95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s 終末延伸，4 ℃保存。引物序列如下：鼠抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（F：5′- CATTGGGAAGTTTCAAATCAGC-3′；R：5′-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3′）；鼠抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（bcl-2-associated X protein，Bax）（F：5′-TTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3′；R：5′-CAGCCTTGAGCACCAGTTTG-3′）；caspase-3（F：5′-CTGGGAAGGGTTGTGAATGA-3′；R：5′-CAGTTTGGCTTGCTGGTCTC-3′）。根據(jù)使用說明調(diào)整基線，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相對表達(dá)量。

1.8 免疫印跡法（Western Blot） 收集對數(shù)期生長的MCF-7 細(xì)胞1 × 107個，加入預(yù)冷PBS，清洗3 次；加入RIPA 細(xì)胞裂解液，收集上清；測定蛋白濃度。加入SDS 上樣緩沖液充分混勻，置于95 ℃水浴中10 min，使蛋白變性。將10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離蛋白轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上并浸入密封液中1 h。沖洗，分別加入Bcl-2 抗體（1∶500 稀釋）、Bax 抗體（1∶500 稀釋）、caspase-3 抗體（1∶1 000 稀釋），置于4 ℃搖床上過夜。采用TBST 沖洗3 次，加入二抗（1∶5 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，洗膜，顯影5 min，采用Alpha 凝膠成像分析系統(tǒng)分析凝膠光密度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 對MCF-7 細(xì)胞增殖活性的影響 經(jīng)MTT 法檢測，不同濃度TNF-α 對MCF-7 細(xì)胞增殖的抑制率分別為（9.86±1.38）%、（15.41±3.77）%、（36.28±7.15）%、（58.34±6.86）%、（64.78±7.45）%，IC50為205.7 ng/mL（圖1）。

圖1 經(jīng)MTT 法檢測TNF-α 對MCF-7 細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Proliferation of MCF-7 cells induced by TNF-α by MTT assay

2.2 Si-SMS2 慢病毒轉(zhuǎn)染效果 慢病毒按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI；MOI=病毒數(shù)量/細(xì)胞數(shù)量）為50 時轉(zhuǎn)染效率較高，細(xì)胞狀態(tài)良好。經(jīng)qRT-PCR 法檢測，SiR2 組細(xì)胞SMS2 mRNA 表達(dá)水平明顯低于CTL 組和SiR-Con 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 49.75，P＜0.000），基因表達(dá)水平分別下降62.5%和64%（圖2）。

2.3 SMS 酶活性測定 經(jīng)凝膠圖像分析儀掃描，CTL 組、TNF-α組、SiR-Con 組、SiR2 組SMS 酶活性灰度值分別為（18.17±3.78）、（12.26±3.15）、（11.53±3.65）、（4.35±1.29），經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，TNF-α組、SiR-Con組以及SiR2組細(xì)胞SMS酶活性灰度值均低于CTL 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細(xì)胞SMS 酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 MCF-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SMS2 siRNA 后SMS2 mRNA 表達(dá)情況Fig.2 SMS mRNA levels of MCF-7 cells transfected with SMS2 siRNA

圖3 基因沉默后SMS 酶活性比較Fig.3 Changes of SMS activity after RNA interference

2.4 MCF-7 細(xì)胞凋亡情況

2.4.1 經(jīng)Hoechst33258/PI 雙染法觀察各組活細(xì)胞狀態(tài) 如圖4A 所示，活細(xì)胞為藍(lán)色，而壞死細(xì)胞核呈紅色并腫大，凋亡細(xì)胞可見細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、皺縮、致密的紅色或亮藍(lán)色。CTL 組可見正常細(xì)胞的有絲分裂，而TNF-α組、SiR-Con 組和SiR2組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死，尤其是SiR2 組細(xì)胞紅色標(biāo)記細(xì)胞明顯多于其他3組。CTL組、TNF-α組、SiR-Con 組、SiR2 組細(xì)胞凋亡率分別為（3.11 ±0.69）%、（14.29 ± 2.71）%、（13.85 ± 1.96）%、（31.08± 5.46）%，細(xì)胞壞死率分別為（0.63 ± 0.12）%、（1.72 ± 0.38）%、（1.65 ± 0.40）%、（3.75 ± 0.47）%，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，TNF-α組、SiR-Con 組以及SiR2 組細(xì)胞凋亡率和壞死率均高于CTL 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且與TNF-α組、SiR-Con組相比，SiR2 組細(xì)胞凋亡率和壞死率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B、4C）。

圖4 Hoechst33258/PI 雙染法觀察各組細(xì)胞凋亡率和壞死率Fig.4 Apoptosis and death rates of MCF-7 cells observed by Hoechst33258/PI staining

2.4.2 FITC-annexin V/PI 雙染法觀察各組細(xì)胞凋亡情況 經(jīng)FCM 法檢測（圖5A），CTL 組、TNF-α組、SiR-Con 組、SiR2 組細(xì)胞凋亡率分別為（7.15 ±2.14）%、（21.46 ± 5.72）%、（23.05 ± 7.28）%、（39.57±7.35）%，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的3組細(xì)胞，TNF-α組、SiRCon 組以及SiR2 組細(xì)胞凋亡率均高于CTL 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5B。

2.5 SMS2 基因沉默對MCF-7 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 qRT-PCR 法檢測 如圖6A 所示，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，TNF-α組、SiR-Con組以及SiR2組細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)量明顯低于CTL 組，而Bax 和caspase-3基因表達(dá)量均高于CTL 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細(xì)胞Bcl-2 基因表達(dá)量進(jìn)一步降低，Bax 和caspase-3 基因表達(dá)則進(jìn)一步上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5.2 Western Blot 檢測 如圖6B 所示［1］，與qRTPCR法檢測結(jié)果基本一致，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，TNF-α組、SiR-Con 組以及SiR2 組細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)量明顯低于CTL 組，而Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)量均高于CTL 組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而且與TNF-α組、SiR-Con 組相比，SiR2 組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量進(jìn)一步降低，Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)則進(jìn)一步上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

HAMPTON 等［6］首次發(fā)現(xiàn)可溶性神經(jīng)鞘磷脂與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。尤其是Cer 作為神經(jīng)鞘磷脂家族最重要的成員之一，既是細(xì)胞膜的主要組成成分，也是細(xì)胞凋亡、增殖、活化等過程的重要參與者。而與催化Cer 相關(guān)的關(guān)鍵酶SMS 也逐漸引起眾多學(xué)者的關(guān)注。近幾年，有研究發(fā)現(xiàn)SMS 活性改變可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。SMS 包含SMS1 和SMS2 兩種同工酶，細(xì)胞內(nèi)SMS2 缺乏可以明顯降低SMS 酶活性以及細(xì)胞內(nèi)SM 的水平［7］。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測SMS2 基因沉默對MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Apoptosis of MCF-7 cells by flow cytometry

圖6 SMS2 基因沉默對MCF-7 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The mRNA and protein levels of apoptosis-related factors

本研究首先通過MTT 法檢測不同濃度梯度的TNF-α對MCF-7 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，最終選擇IC50濃度即205.7 ng/mL 作為后續(xù)研究的作用濃度。TNF-α是由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一類最重要的細(xì)胞因子，作用機(jī)制復(fù)雜，對乳腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)雙向調(diào)控作用［8］。在體外可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促使其凋亡；而在體內(nèi)則可通過調(diào)控機(jī)體免疫功能以及促炎性反應(yīng)等，促使腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡［9］。最新有研究證實(shí)TNF-α可通過激活酸性神經(jīng)鞘磷脂降解鞘磷脂，從而生成Cer，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［10］。因此本項(xiàng)研究旨在分析SMS2 基因沉默對TNF-α誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞體外凋亡實(shí)驗(yàn)的影響。

既往報(bào)道稱，SMS 基因異常表達(dá)不僅影響SMS酶活性，對細(xì)胞和培養(yǎng)基中SM 的水平也有一定的調(diào)節(jié)作用［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SMS2 基因表達(dá)后，MCF-7 細(xì)胞內(nèi)SMS 酶活性顯著降低。同時出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征，與空白MCF-7 細(xì)胞組或者單純TNF-α誘導(dǎo)組相比，si-SMS2 組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加。因此，筆者推測沉默MCF-7 細(xì)胞SMS2 基因表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)SMS 酶活性降低，底物Cer 利用率隨之下降，而剩余的Cer 水平也相應(yīng)升高，Cer 作為公認(rèn)的促凋亡信號分子，可能與多種信號通路調(diào)節(jié)或凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。隨后筆者進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后，TNF-α組、SiRCon 組以及SiR2 組細(xì)胞Bcl-2 基因表達(dá)量明顯低于CTL 組，而Bax 和caspase-3 基因表達(dá)量均高于CTL組細(xì)胞，并且與TNF-α組、SiR-Con組相比，SiR2組細(xì)胞Bcl-2 基因表達(dá)量進(jìn)一步降低，Bax 和caspase-3基因表達(dá)則進(jìn)一步上調(diào)。據(jù)判斷，SMS2 作為催化卵磷脂和Cer 生成SM 和甘油二酯的關(guān)鍵酶，其表達(dá)下調(diào)，則底物Cer 水平相應(yīng)增加，DAG 和SM水平隨之減少。作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，Cer和DAG 均與凋亡酶系統(tǒng)、線粒體凋亡途徑等密切相關(guān)［12］。其中Bcl-2 蛋白家族和caspase 家族是目前最受關(guān)注的、作用最為確切的凋亡調(diào)控基因。Bcl-2 家族蛋白屬于抗凋亡因子，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C 的釋放來促進(jìn)Bax 或抑制Bcl-2 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。當(dāng)抗凋亡基因Bcl-2 表達(dá)上調(diào)時，Bcl-2與Bax 形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡。而caspase-3是多種凋亡途徑共同的下游調(diào)控蛋白，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白”［14］。而近年來關(guān)于Bcl-2、Bax、caspase-3 三者的關(guān)系研究也發(fā)生了突破性進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bax 不僅是caspase-3 的上游調(diào)控基因，同時也是caspase-3 的直接作用底物，三者既相互聯(lián)系，又相互制約［15］。因此，通過本項(xiàng)研究說明SMS2 基因沉默后細(xì)胞凋亡作用與死亡受體通路和線粒體途徑均密切相關(guān)。

綜上所述，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乳腺癌細(xì)胞脂質(zhì)筏中SMS2 基因缺失與促使細(xì)胞凋亡有關(guān)。SMS2 基因沉默可降低細(xì)胞內(nèi)SMS 酶活性，通過抑制抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，同時上調(diào)促凋亡基因Bax 和caspase-3 的表達(dá)水平，提高TNF-α誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，因此及SMS2 基因表達(dá)調(diào)控可成為乳腺癌化療藥物的重要干預(yù)靶點(diǎn)。但是本項(xiàng)研究只是初步證明SMS2 基因沉默與乳腺癌細(xì)胞的凋亡存在一定的聯(lián)系，如證實(shí)這個具體的作用機(jī)制，還需要納入更多的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步深入且細(xì)致地研究。