謝鄒祺 代榮陽 張春燕

西南醫(yī)科大學1肝臟疾病實驗室，2基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室（四川瀘州646699）

肝癌是我國常見惡性腫瘤，目前臨床治療傾向于從單一轉(zhuǎn)為多樣化治療［1-2］。ABT737是由美國Abbott 公司研究開發(fā)的一種Bcl-2 小分子抑制劑，可與Bcl-2/Bcl-XL 結(jié)合而拮抗其抗凋亡作用［3］。研究［4-6］發(fā)現(xiàn)ABT737 對多種癌細胞具有細胞毒性，可在卵巢癌、肺癌和膀胱癌等各種癌癥類型中誘發(fā)顯著的細胞凋亡。如石少敏等［7］發(fā)現(xiàn)ABT737可增加GSK3 抑制劑SB216763 引起的人非小細胞肺癌A549 細胞凋亡；王煥等［8］發(fā)現(xiàn)ABT737 可通過激活JNK/c-Jun 信號通路，從而使凋亡蛋白Bim 的表達上調(diào)，誘導人宮頸癌HeLa 細胞凋亡。因此，ABT737 對癌細胞的凋亡作用比較明確。

小分子化合物salubrinal 是一種化學合成劑，通過誘導真核翻譯起始因子eIF2α51 位絲氨酸發(fā)生磷酸化而抑制真核翻譯起始因子的活性［9-10］。如陳永華等［11］研究發(fā)現(xiàn)salubrinal 能夠抑制銅負荷引起的肝細胞凋亡，具有干預PERK/eIF2α 信號通路作用；劉利娟等［12］發(fā)現(xiàn)在大鼠MCAO 缺血再灌注損傷模型中salubrinal 可下調(diào)LC3-Ⅱ的mRNA 表達及LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA 比值，進而改善神經(jīng)功能缺損，起到神經(jīng)保護作用。盡管目前的研究發(fā)現(xiàn)salubrinal 可抑制細胞凋亡［13-15］，但具體機制尚不清楚。

為了探索salubrinal 對人肝癌細胞株Sk-Hep1凋亡的影響及作用機制，本實驗采用salubrinal 預處理人肝癌細胞株Sk-Hep1，再以ABT737 誘導癌細胞凋亡后，檢測細胞凋亡的分子標記——剪切的PARP 表達、DNA 損傷的分子標記——磷酸化H2AX 蛋白表達以探索salubrinal 對ABT737 誘導的Sk-Hep1 肝癌細胞凋亡的影響。為了進一步探索salubrinal 抑制eIF2α51 去磷酸化水平的作用是否與這種相互作用相關(guān)，本實驗檢測了在ABT737誘導的Sk-Hep1 細胞凋亡中，salubrinal 作用后p-eIF2α、eIF2α蛋白的表達水平，并在聯(lián)用ABT737和salubrinal 處理Sk-Hep1 肝癌細胞后，轉(zhuǎn)染eIF2α的兩種突變體即51 位絲氨酸不能磷酸化突變體（eIF2αS51A）以及51 位絲氨酸磷酸化突變體（eIF2αS51D）、質(zhì)粒，進一步檢測剪切的PARP、p-eIF2α 蛋 白 表 達 變 化，以 此 探 索salubrinal 對ABT737 處理后Sk-Hep1 的細胞的影響及與eIF2α通路的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品和抗體 Salubrinal 購自美國Santa Cruz公司，ABT737 購自美國Selleck Chemicals 公司，抗PARP、p-eIF2α 和磷酸化H2AX 一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，抗eIF2α 和GAPDH 一抗購自美國Santa Cruz 公司。Lipofectamine 2000 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，eIF2αS51A 質(zhì)粒、eIF2αS51D 質(zhì)粒、人肝癌細胞株Sk-Hep1 為實驗室保存。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞Sk-Hep1 用DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)于5% CO2，37 ℃孵箱。每隔2～3 d 換液，待細胞生長達到對數(shù)生長期時進行實驗。本實驗經(jīng)過本單位倫理委員會的審批。

1.3 Western Blot 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質(zhì)，采用hoefer 半干電轉(zhuǎn)移將蛋白分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后的NC 膜用Tris 鹽酸緩沖液（TBST）洗滌3 次（5 min/次），封阻緩沖液（5%BSA）在室溫下密閉輕搖封阻1 h。TBST 洗滌3次（5 min/次）后，NC 膜與一抗稀釋液室溫下輕搖動孵育30 min，4 ℃冰箱過夜，回收一抗，TBST 洗滌3次（5 min/次）。NC 膜與熒光二抗稀釋液于室溫下輕搖動孵育1 h，回收二抗，TBST 洗滌3次（5 min/次）。Odyssey-CLX掃描顯影。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細胞接種于六孔板中，將2.5 μg的eIF2αS51A、eIF2αS51D 的儲存液分別與100 μL Opti-MEM 混合，同時將8 μL Lipofectamine 2000 與100 μL Opti-MEM 混合，然后將兩種溶液混勻并加入正常培養(yǎng)的Sk-Hep1 細胞中。培養(yǎng)6 h 后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.5 蛋白提取 根據(jù)實驗分組，待藥物處理達到預定時間后，棄掉六孔板中培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次，隨即向各孔中加入適量含蛋白酶抑制劑的IP 裂解液（約100 μL），輕微晃動，使IP 裂解液覆蓋所有細胞，將六孔板置于冰上約20 min。用細胞刮將細胞刮下并用1.5 mL EP 管收集，用超聲波細胞粉碎冰上超聲破碎細胞，超聲3 次（5 s/次）。用4 ℃低溫離心機12 000 r/min 離心15 min，取離心后上清液裝入新的1.5 mL EP 管中，置于冰上。樣品變性：根據(jù)EP 管中取得的蛋白樣品總體積，加入1/5 總體積的5×蛋白loading buffer，充分混勻后，在100 ℃蜂窩爐煮變性5～10 min，最后放在冰上約3 min。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0 軟件分析數(shù)據(jù)，所有實驗至少重復3 次，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。統(tǒng)計學比較采用t檢驗、單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ABT737 誘導Sk-Hep1 肝癌細胞凋亡及DNA損傷 采用不同濃度ABT737（0、2.5、5、10 μmol/L）刺激Sk-Hep1 肝癌細胞24 h 后，通過Western Blot檢測分析剪切的PARP 蛋白及磷酸化H2AX 蛋白表達情況，結(jié)果顯示，隨著ABT737 濃度增加，剪切的PARP 蛋白（圖1A）及磷酸化H2AX 蛋白表達（圖1B）增加，并呈現(xiàn)濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義。這表明ABT737 促進了Sk-Hep1 肝癌細胞中細胞凋亡的分子標記——剪切的PARP 蛋白表達上調(diào)，同時也促進了DNA 損傷標志蛋白——磷酸化H2AX 蛋白的表達增加。依據(jù)現(xiàn)有文獻［4-7］，結(jié)合本實驗所用細胞對ABT737 的反應性，本研究從0、2.5、5、10 μmol/L 中選取了一個效果較為明顯的濃度——5 μmol/L 來檢測ABT737 對Sk-Hep1 肝癌細胞作用與時間的關(guān)系。采用5 μmol/L 的ABT737 處理Sk-Hep1 細胞6、12、24、36 h 后，Western Blot 檢測分析剪切的PARP 蛋白及磷酸化H2AX 蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，剪切的PARP 蛋白（圖1C）及磷酸化H2AX 蛋白表達（圖1D）增加，并呈時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 ABT737 上調(diào)Sk-Hep1 細胞中剪切的PARP 及磷酸化H2AX 蛋白水平Fig.1 ABT737 upregulated the cleavaged PARP protein and phosphorylated H2AX protein in Sk-Hep1 cells

2.2 Salubrinal 對ABT737 在肝癌細胞Sk-Hep1中誘導的細胞凋亡及DNA 損傷具有拮抗作用 采用salubrinal 對肝癌細胞Sk-Hep1 預處理1 h 后再聯(lián)用ABT737（5 μmol/L），運用Western Blot 技術(shù)分別在ABT737 作用24、36 h 兩個時間點檢測剪切的PARP 蛋白表達（圖2A）及磷酸化H2AX 蛋白表達（圖2B）。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，salubrinal聯(lián)用ABT737組與單用ABT737組相比，在24、36 h兩個時間點上剪切的PARP 蛋白與磷酸化的H2AX 蛋白表達量均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義。這表明salubrinal對ABT737在肝癌細胞Sk-Hep1中誘導的細胞凋亡及DNA損傷具有拮抗作用。

圖2 聯(lián)用salubrinal 與ABT737 可下調(diào)Sk-Hep1 細胞中剪切的PARP 及磷酸化H2AX 蛋白水平Fig.2 ABT737 combined with salubrinal down-regulated the level of cleavaged PARP and phosphorylated H2AX protein in Sk-Hep1 cells

2.3 Salubrinal對ABT737的拮抗作用可能與eIF2α通路無關(guān) 為了探索salubrinal對肝癌細胞Sk-Hep1中ABT737 的拮抗作用是否與其對eIF2α去磷酸化的抑制有關(guān)，本研究在肝癌細胞Sk-Hep1 中使用salubrinal 預處理1 h 后，ABT737（5 μmol/L）處理24、36 h，Western Blot檢測p-eIF2α、eIF2α蛋白表達。統(tǒng)計學結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)各組蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化（圖3A）。肝癌細胞Sk-Hep1 用lip2000 轉(zhuǎn)染eIF2αS51A、eIF2αS51D 質(zhì)粒后，ABT737（5 μmol/L）處理24、36 h 后，運用Western Blot 檢測剪切PARP、p-eIF2α蛋白表達（圖3B），統(tǒng)計學結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)各組沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義。這說明salubrinal 減弱ABT737 誘導的凋亡以及DNA 損傷與eIF2α通路可能沒有關(guān)系。

圖3 Salubrinal 對ABT737 的拮抗作用可能與eIF2α通路無關(guān)Fig.3 The antagonism role of salubrinal against ABT737 may be unrelated to eIF2α pathway

3 討論

剪切的PARP 蛋白是細胞凋亡的分子標記，而磷酸化H2AX 蛋白是DNA 損傷的標志蛋白，本研究證實了ABT737 這種小分子物質(zhì)在Sk-Hep1 肝癌細胞中誘導了細胞凋亡和DNA 損傷。實驗發(fā)現(xiàn)在不同濃度ABT737 作用下Sk-Hep1 肝癌細胞中的剪切PARP 及磷酸化H2AX 蛋白表達隨著ABT737 濃度的增加而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性（圖1A、B）。本實驗還根據(jù)文獻［4-7］結(jié)合Sk-Hep1 細胞對ABT737 的反應性，選取了效果明顯的濃度——5 μmol/L 來進一步檢測ABT737 對Sk-Hep1 肝癌細胞誘導的細胞凋亡及DNA 損傷與時間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ABT737 的這種作用呈現(xiàn)時間依賴性（圖1C、D）。因此證實了ABT737 在Sk-Hep1 肝癌細胞中能夠誘導的細胞凋亡及DNA 損傷，且這種作用呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，這與他人報道的ABT737 在多種癌細胞中的細胞毒性作用結(jié)論一致［4-7］。

Salubrinal 是一種選擇性eIF2α 去磷酸化抑制劑，通過磷酸化eIF2α 而活化eIF2α 通路，這導致應激反應通路的激活，表現(xiàn)出細胞保護作用［16-20］，salubrinal 在于抗癌藥物聯(lián)合使用時可以減弱或促進不同化療藥物的抗腫瘤作用，如順鉑和多柔比星［21-23］。目前的癌癥治療傾向于多藥聯(lián)合使用，而ABT737 是抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 的一種強力抑制劑，具有協(xié)同細胞毒性，在卵巢癌、膽管癌、肺癌等多種癌癥中均可誘導細胞凋亡［4-7，18］，是具有臨床應用潛力的抗癌藥物。本實驗首次聯(lián)合應用salubrinal與ABT737處理Sk-Hep1 肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用兩種藥物導致剪切的PARP 蛋白表達量、磷酸化的H2AX 蛋白表達量都明顯下調(diào)，這說明salubrinal 對ABT737誘導的細胞凋亡和DNA 損傷具有拮抗作用。本研究中檢測到聯(lián)合應用salubrinal、ABT737 處理Sk-Hep1細胞后p-eIF2α、eIF2α蛋白表達無明顯變化，且轉(zhuǎn)染eIF2αS51A、eIF2αS51D 質(zhì)粒對ABT737誘導的PARP 剪切和p-eIF2α蛋白表達也無明顯影響。綜合上述，推測salubrinal 拮抗ABT737 誘導的Sk-Hep1 的細胞凋亡作用與eIF2α通路可能沒有關(guān)系。

總而言之，本研究揭示了salubrinal 對ABT737誘導的細胞凋亡和DNA損傷具有拮抗作用，這提示臨床上使用藥物聯(lián)合治療肝癌細胞時應避免這兩類藥物同時應用，同時，本研究也探索了salubrinal這種拮抗作用涉及的相關(guān)通路蛋白，發(fā)現(xiàn)該作用可能與eIF2α通路無關(guān)。Salubrinal 與某些抗癌藥物聯(lián)合使用時具有增強抗癌藥物的效果，如順鉑和多柔比星［21-23］，但在與某些抗癌藥物聯(lián)合應用時表現(xiàn)出的拮抗作用機制不甚清楚，尚需進一步擴大相關(guān)通路蛋白的檢測以便了解其作用機制，并為臨床應用提供理論基礎(chǔ)。