張 靜，史開(kāi)志，王 婧，張 雄

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)是1種革蘭氏陰性、具有多種不同形態(tài)的條件性致病菌，會(huì)引起纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心包炎為主要病理特征的疾病[1]。主要引起2周齡到4月齡的豬發(fā)病，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)50%[2]。近年來(lái)，貴州省生豬產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，與此同時(shí)豬場(chǎng)內(nèi)各種免疫抑制性疾病情況日趨復(fù)雜，豬場(chǎng)單獨(dú)感染或繼發(fā)感染副豬嗜血桿較為普遍，造成的經(jīng)濟(jì)損失也越發(fā)嚴(yán)重。副豬嗜血桿菌有15種血清型，各血清型之間的致病力存在極大的差異，其中血清1型、5型、10型、12型、13型和14型具有高致病性，通常在感染4天后發(fā)病或死亡。我國(guó)的豬群中廣泛存在且流行的血清型主要是血清4型、5型、12型和13型為主[3]。鑒于副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)條件嚴(yán)苛，且傳統(tǒng)方法無(wú)法完全區(qū)分副豬嗜血桿菌的血清型[4]，Olvera A等[5]從細(xì)菌16S rRNA的種屬特性出發(fā)，設(shè)計(jì)了副豬嗜血桿菌16S rRNA基因特異性引物，擴(kuò)增得到822 bp特異片段，經(jīng)過(guò)序列分析可針對(duì)性地鑒定副豬嗜血桿菌，且可通過(guò)酶切將不同血清型的副豬嗜血桿菌分為不同的基因型。綜合傳統(tǒng)培養(yǎng)特性和16S rRNA序列特性對(duì)副豬嗜血桿菌臨床分離株進(jìn)行鑒定和分型，能有效克服傳統(tǒng)方法對(duì)副豬嗜血桿菌分型鑒定存在的困難。

2018年9月初，貴陽(yáng)市花溪區(qū)麥坪鎮(zhèn)某豬場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生疫病，病豬臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、跛行等癥狀；剖檢病理變化主要為肺實(shí)質(zhì)性病變，心包內(nèi)充滿積液，胸腹腔有纖維素性滲出，胸腔積水，關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液。為確診和控制疫情，本實(shí)驗(yàn)對(duì)送檢的病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病料來(lái)源:發(fā)病豬場(chǎng)送檢的2頭疑似感染副豬嗜血桿菌病豬。

1.1.2主要試劑:(1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酵母粉、NaCl、蛋白胨、牛肉浸膏、新生牛血清、NAD、革蘭氏染色試劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。(2)細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司和杭州微生物試劑有限公司。(3)2×EsTaqMasterMix(Dye)，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。(4)DNAiso plus、DL-2 000 DNA Marker，購(gòu)自TaKaRa生物公司。

1.1.3培養(yǎng)基:(1)副豬嗜血桿菌固體培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂3.3 g，酵母粉1 g，溶于超純水 90 mL中，調(diào)節(jié)pH值至7.3～7.4，121℃滅菌 25 min，冷卻至 50℃左右，加入NAD 1 mL和新牛血清10 mL，倒入平皿，凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜無(wú)雜菌生長(zhǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?2)副豬嗜血桿菌液體培養(yǎng)基:NaCl 1 g，蛋白胨 1 g，酵母粉 0.5 g，牛肉浸膏 1 g，加入蒸餾水90 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.3～7.4，121℃滅菌25 min，冷卻至室溫，加入NAD 1 mL和新牛血清10 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)及涂片鏡檢:無(wú)菌條件下，取發(fā)病豬的肺臟分別接種于液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基上，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長(zhǎng)狀況和形態(tài)，挑取菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2生化試驗(yàn):將分離細(xì)菌純培養(yǎng)物分別接種于添加1 μg/mL NAD的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇等微量生化鑒定管，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序:提取菌液DNA為模板，應(yīng)用Olvera A等[5]設(shè)計(jì)的16S rRNA序列引物(F:5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，R:5’-GGCT TCGTCACCCTCTGT-3’)對(duì)目的基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增片段大小為822 bp。(1)PCR擴(kuò)增體系25 μL:2×EsTaqMasterMix(Dye)12.5 μL，1 μmol/L上游引物 1 μL，1 μmol/L 下游引物 1 μL，模板 DNA 2 μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊至 25 μL。 (2)PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃冷卻2 min。取PCR產(chǎn)物6 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.416S rRNA基因同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析:運(yùn)用DNAStar軟件，將分離菌株與NCBI上15種血清型副豬嗜血桿菌參考株16S rRNA基因的核酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5藥敏試驗(yàn):無(wú)菌條件下，取處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌液100 μL于固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌涂布器將菌液均勻涂滿整個(gè)平皿，然后用滅菌鑷子夾取13種藥敏紙片放在適當(dāng)?shù)奈恢茫p輕按壓固定。晾干后倒置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，測(cè)定抑菌環(huán)的大小，判斷藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征分離菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，肉眼可觀察到針尖大小、無(wú)色透明的菌落(見(jiàn)圖1)。挑取單個(gè)菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀、長(zhǎng)線狀等多種形態(tài)(見(jiàn)圖2)。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果對(duì)純化細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌株各項(xiàng)生化鑒定結(jié)果符合副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的特征[6]。見(jiàn)表1。

圖1 分離菌菌落形態(tài)

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢(10×100)

表1 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.3PCR 擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果為進(jìn)一步確定該菌，以該分離菌株DNA為模板，利用副豬嗜血桿菌16S rRNA引物成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為822 bp的基因片段，得到與預(yù)期目的片段大小相一致的擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)圖3)，確定為副豬嗜血桿菌(命名為:GZ_MP_HPS001)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 16S rRNA基因同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

2.4.116S rRNA基因同源性比較分析:將GZ_MP_HPS001的16S rRNA基因核苷酸序列與其他參考菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖5。GZ_MP_H PS001與參考菌株的16S rRNA核苷酸序列同源，且相似性為97.4%～100%；與血清5型參考菌株的核苷酸序列相似性高達(dá)100%。

圖3 分離菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 分離菌(GZ_MP_HPS001)16S rRNA序列

圖5 GZ_MP_HPS001與參考菌株同源性比對(duì)結(jié)果

2.4.216S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析:應(yīng)用DNAStar軟件ClustaW算法對(duì)GZ_MP_HPS001分離株16S rRNA基因核苷酸序列及參考菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果GZ_MP_HPS001與血清5型Hps參考株屬于同一分支。見(jiàn)圖6。

圖6 基于Hps 16S rRNA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇13種藥敏紙片對(duì)該菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果分離菌株對(duì)利福平、頭孢氨芐、阿米卡星、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素敏感，對(duì)阿莫西林、林可霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、紅霉素、青霉素、慶大霉素耐藥(見(jiàn)表2)。該豬場(chǎng)可選擇利福平、頭孢氨芐等5種敏感藥物對(duì)病豬進(jìn)行治療。

表2 副豬嗜血桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1根據(jù)對(duì)豬場(chǎng)送檢病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增及測(cè)序，綜合鑒定分離菌為副豬嗜血桿菌(命名為:GZ_MP_HPS001)，確診該豬場(chǎng)發(fā)病原因?yàn)楦必i嗜血桿菌感染所致。分離菌株與1～15型參考菌株的核苷酸序列同源性為97.4%～100%，其中與血清5型副豬嗜血桿菌序列同源性高達(dá)100%；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，該菌株與血清5型副豬嗜血桿菌聚到1個(gè)分支上，說(shuō)明該菌株與血清5型副豬嗜血桿菌的親緣關(guān)系最近，表明從該場(chǎng)分離得到的菌株為血清5型副豬嗜血桿菌。這符合中國(guó)流行的副豬嗜血桿菌血清型為4型和5型的情況[7～9]，也說(shuō)明副豬嗜血桿菌的血清型與基因型存在一致性。

3.2副豬嗜血桿菌5型屬于目前國(guó)內(nèi)流行的血清型之一。臨床上感染該血清型的豬在4天內(nèi)發(fā)病或者死亡。相關(guān)感染試驗(yàn)表明，氣管或腹腔感染副豬嗜血桿菌的豬常因急性敗血癥在接種1～2 d后出現(xiàn)死亡[10～13]。該豬場(chǎng)出現(xiàn)的疫情與感染血清5型副豬嗜血桿菌發(fā)病急、影響大的特點(diǎn)相一致。

3.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)利福平、頭孢氨芐、阿米卡星、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素高度敏感，發(fā)病豬場(chǎng)用上述敏感藥物進(jìn)行治療和預(yù)防都有很好的效果。副豬嗜血桿菌不同的血清型之間的藥物敏感性存在差異，即使是同一血清型，來(lái)自不同地區(qū)的不同菌株對(duì)同一種藥物的敏感性也有很大差異，故臨床用藥要根據(jù)分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果采取針對(duì)性的防治措施。從預(yù)防的角度來(lái)講，疫苗免疫是預(yù)防副豬嗜血桿菌的有效方法之一，該場(chǎng)可利用分離的副豬嗜血桿菌制備自家疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫接種。