張喜懿，溫貴蘭，張升波，李昌紅，徐 麗，田 浪，

楊佰啟，陳 廣，程振濤，王開功，周碧君，文 明

(貴州大學動物科學學院預防獸醫(yī)學實驗室，貴州 貴陽 520025)

附紅細胞體病(Eperythrozoonosis)是由附紅細胞體(Eperythrozoon)引起的以溶血性貧血、黃疸、發(fā)熱為主要特征的人獸共患傳染病，又稱紅皮病、黃疸性貧血、類邊蟲病、赤獸體病[1，2]。 1932 年，Doyle[3]首次報道了豬附紅細胞體病，認為其病原體屬于類立克氏體科，直到國際系統(tǒng)原核生物學委員會和2005年版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》將其從立克次體科劃入支原體科，附紅細胞體的生物學地位才確定下來[4]。在我國，附紅細胞體病已經(jīng)有了幾十年的流行史，該病多發(fā)于夏秋季節(jié)，易造成流行，且寄主范圍廣，涉及豬、牛、羊等多種動物[5]。

貴州省長順縣某養(yǎng)殖場存欄生豬135頭，平均日齡40 d，體重約30 kg，為長白豬與大約克豬的雜交品種。2018年12月5日開始發(fā)病，至12日病死豬達100頭，死亡率高達74.07%。發(fā)病豬除消瘦和被毛粗亂外無其他明顯癥狀，剖檢病死豬未發(fā)現(xiàn)典型病理變化。場主曾使用獸用非處方藥“日超三斤”治療，未見療效。本實驗室隨機無菌采集5頭發(fā)病豬的血液進行檢測診斷，以確定該場豬群發(fā)病死亡的原因，為預防和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測病料無菌采集5頭發(fā)病豬的血液。

1.2 主要試劑革蘭氏染色液，購自杭州微生物試劑有限公司；姬姆薩染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；基因組RNA快速抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)引物，來源于貴州大學預防獸醫(yī)學實驗室。

1.3 細菌分離培養(yǎng)在超凈工作臺中，用滅菌接種環(huán)蘸取適量血液樣本，均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種后的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落生長情況。

1.4 病毒核酸檢測

1.4.1病毒核酸提取:按照生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的基因組RNA快速抽提試劑盒說明書進行總RNA的提取，按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒說明書進行總DNA的提取。

1.4.2cDNA的合成:將提取的病毒總RNA根據(jù)北京康為世紀公司生產(chǎn)的HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，反應總體系設為 20 μL，其中:dNTP Mix、2.5 mmol/L Each 4 μL，Primer Mix 2 μL， RNA Template 2 μL， 5xRT.Buffer 4 μL，0.1 mmol/L DTT 2 μL， HiFiScript(200 U/μL)1 μL，RNase-Free water 5 μL。 加樣完成后充分混勻，于42℃水浴鍋中孵育50 min，85℃水浴鍋中孵育5 min，再于小型離心機上4 000 r/min離心10 s，置于冰上冷卻即反轉錄成cDNA，保存于4℃冰箱中備用。

1.4.3PCR擴增:將4對引物分為2組，分別對核酸樣本進行PCR擴增，PCV2特異性引物為第1組，CSFV、JEV、PRRSV 3對特異性引物為第2組。反應總體系設為20 μL，其中:上游引物(Forward Primer，F(xiàn))0.5 μL，下游引物(Reverse Primer，R)0.5 μL，cDNA 2.0 μL，Taq酶 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL，加樣完成后立即進行PCR擴增。第1組引物PCR擴增程序:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，共35次循環(huán)；72℃再延伸10 min，PCV2特異性引物的預期擴增片段大小為1 767 bp。第2組引物PCR擴增程序:95℃ 5 min；95℃ 1 min，54℃ 45 s，72℃ 2 min，共 35次循環(huán)；72℃再延伸 10 min，CSFV、JEV、PRRSV 3對特異性引物的預期擴增片段大小分別為 504、271、372 bp。

1.4.4PCR產(chǎn)物凝膠電泳:將所得的PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳后的凝膠塊放入凝膠成像儀中，分析結果并拍照保存。

1.5 血涂片檢查

1.5.1革蘭氏染色鏡檢:血涂片革蘭氏染色，用顯微鏡進行檢查。

1.5.2姬姆薩染色鏡檢:(1)常規(guī)方法制備血涂片，待血膜干后，用甲醇固定2～3 min。(2)將血涂片置于染色架上，滴加稀釋好的姬姆薩染色液，使其覆蓋整個血膜，室溫染色15～30 min。(3)用蒸餾水緩慢從玻片一端沖洗，自然風干后鏡檢。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果接種血液后的普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)37℃培養(yǎng)16 h后，未發(fā)現(xiàn)菌落生長。

2.2 病毒核酸檢測結果使用PCV2、CSFV、JEV、PRRSV特異引物對核酸樣本進行PCR擴增，將所得PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，均未出現(xiàn)預期擴增條帶，4種病毒檢測均為陰性。見圖1。

圖1 4種病毒核酸PCR擴增檢測結果

2.3 血涂片檢查結果

2.3.1革蘭氏染色鏡檢結果:血涂片革蘭氏染色鏡檢未觀察到細菌。

2.3.2姬姆薩染色鏡檢結果:5頭發(fā)病豬血涂片姬姆薩染色鏡檢結果見圖2～圖6?？梢娨曇爸械拇蟛糠旨t細胞出現(xiàn)明顯變形，失去其原有的雙凹形和表面光滑的形態(tài)，邊緣不整齊，呈星芒狀、鋸齒狀、刺球狀等不規(guī)則形狀；附著在紅細胞表面的病原體被染成具有折光性的藍紫色不規(guī)則顆粒，油鏡觀察其中間明亮，外周不規(guī)則，鑒定為附紅細胞體。

圖2 1號血液樣本姬姆薩染色鏡檢(10×100倍)

圖3 2號血液樣本姬母薩染色鏡檢(10×100倍)

圖4 3號血液樣本姬姆薩染色鏡檢(10×100倍)

圖5 4號血液樣本姬姆薩染色鏡檢(10×100倍)

圖6 5號血液樣本姬姆薩染色鏡檢(10×100倍)

3 結論與討論

3.1本試驗對采集的5頭發(fā)病豬血液樣本進行細菌分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測和血涂片檢查，確診該場發(fā)病豬群為附紅細胞體感染。

3.2附紅細胞體是一類結構簡單的單細胞類嗜紅細胞性微生物，隸屬于嗜血支原體科、支原體屬[6]。該病一年四季均可發(fā)生，但多見于夏秋季節(jié)，可水平傳播和垂直傳播，主要通過吸血昆蟲和節(jié)肢動物傳播[2，7]。飼養(yǎng)管理條件不當、溫度突然變化、豬群體質弱等因素也會加重病情，導致疫情蔓延，加劇經(jīng)濟損失[8]。本病例中的養(yǎng)殖場為半封閉建設，圈舍環(huán)境衛(wèi)生差，給附紅細胞體的滋生和傳播創(chuàng)造了條件；此外，該場豬之間有相互撕咬的情況，也是造成附紅細胞體在豬群之間傳播和流行的因素。

3.3附紅細胞體病的診斷方法較多，血液涂片檢查是最常見的診斷方法，包括鮮血壓片法和血涂片染色法，前者是最直接、最簡單的診斷方法，但容易出現(xiàn)假陽性結果，導致誤判，一般作為輔助方法[9]；后者包括姬姆薩染色法、瑞氏染色法、瑞氏-姬姆薩混染法及吖啶橙染色法，瑞氏-姬姆薩混染法效果最好。此外還有補體結合試驗、熒光抗體試驗、間接血凝試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗是最敏感且最快速的診斷方法，但該方法受檢測抗原純度的影響可能會出現(xiàn)假陰性結果，一般用于流行病學普查[11]。分子生物學診斷技術也是一種重要的診斷方法，臨床上最常用的是PCR技術，具有較高的特異性和敏感性[12]。盡管目前附紅細胞體病的診斷方法多種多樣，然而因動物感染附紅細胞體后常表現(xiàn)為一過性，給該病的診斷帶來了一定的困難[13]，至今仍沒有一種集靈敏度高、特異性強、簡單快捷于一體的診斷方法可供臨床使用。

3.4治療本病可用貝尼爾(血蟲凈)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，目前尚無疫苗可供使用。本病例中畜主曾使用非處方獸藥“日超三斤”治療，未見療效，該藥主要成分為抗菌肽素、乳酸菌、酵母菌等，主要起催肥促生長作用，對附紅細胞體這類嗜血支原體疾病并無作用。由于畜主沒有在第1時間咨詢獸醫(yī)人員確診并使用正確的治療藥物，錯過了最佳治療時機，延誤了病情，導致豬群的高發(fā)病率和死亡率，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。