錢飛亞，楊 培，張明菲，許阿蘭，王 祥，周學(xué)平，黃 艷，周玲玲

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性全身性自身免疫性疾病[1]。目前，西醫(yī)治療RA主要使用非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、生物制劑等，雖有一定療效，但存在不同程度的不良反應(yīng)[2]。中醫(yī)藥在治療難治性疾病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。滋腎通絡(luò)方(ZishenTongluo formula， ZTF)是根據(jù)國醫(yī)大師周仲瑛教授臨床應(yīng)用幾十年的經(jīng)驗(yàn)方(清絡(luò)通痹方)精簡而成，前期研究發(fā)現(xiàn)，ZTF和原方比較具有相似的治療效果和良好的安全性，其可明顯抑制RA相關(guān)的炎性因子釋放[3]，但具體的作用環(huán)節(jié)尚不明確。

輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th)的活化是RA重要的病理機(jī)制之一，其可以分化為多種亞型，如Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)等。Th細(xì)胞不同亞型可分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子，在全身和局部免疫平衡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。新近的研究表明，Th17/Treg細(xì)胞的分化失衡在RA中起著關(guān)鍵作用[4]。Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素17(interleukin 17， IL-17)能夠促進(jìn)炎癥的發(fā)展，而Treg細(xì)胞能夠分泌IL-10，通過抑制免疫應(yīng)答，阻止炎癥的發(fā)展，兩者在發(fā)育和功能上起著相互拮抗的作用，調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞的分化平衡可成為防治RA的重要策略。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬以Th17/Treg為切入點(diǎn)，通過建立小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型[5]，重點(diǎn)觀察ZTF對RA中Th17/Treg細(xì)胞的分化和平衡的影響，以及對相應(yīng)細(xì)胞因子的干預(yù)作用，以期進(jìn)一步闡明其重建RA免疫平衡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級DBA/1 ♂小鼠，18只，6～8周齡，購自南京大學(xué)模式動物所，許可證號：SYXK(蘇)2014-0001。

1.1.2藥物與試劑 滋腎通絡(luò)方：青風(fēng)藤、雷公藤、生地黃、炙僵蠶和三七按15 ∶15 ∶15 ∶10 ∶3比例混合制成水提液，每升含生藥量0.84 kg。牛Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，CⅡ)，美國Chondrex公司產(chǎn)品；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)，均為美國Sigma公司產(chǎn)品；IL-10和IL-17 ELISA試劑盒，南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品；抗小鼠CD4-FITC(批號7017982)、CD25-APC(批號7235686)、CD127-PE(批號5286644)、IL-17A-PE(批號7180908)、CD4磁珠(批號8211931)，均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.3儀器 BSA224S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；5417R型低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)；HH-6型恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SyneRgy 2型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；熒光顯微鏡(日本尼康公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠CIA模型的建立[6]將CⅡ溶于0.01 mol·L-1的冰醋酸中，配制成2 g·L-1的溶液，4 ℃過夜，將溶解的CⅡ與CFA以1 ∶1比例混和，并充分乳化(在冰上操作)。在DBA/1小鼠尾根靠后處，皮內(nèi)注射100 μL混合乳劑進(jìn)行初次免疫，當(dāng)天記為d 1。d 21將CⅡ與IFA等比混勻乳化，尾根部注射100 μL進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.2.2分組及給藥 DBA/1小鼠18只，12只建立CIA模型，其余6只作為正常對照組。d 21將模型動物隨機(jī)分為模型組和ZTF組。ZTF組每日灌胃給予水煎液8.4 g生藥·kg-1，給藥體積為10 mL·kg-1，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

1.2.3一般情況觀察 每天觀察動物一般狀況，如飲食、行為活動、體質(zhì)量等。

1.2.4關(guān)節(jié)炎癥評分[7]小鼠再次免疫后，每4 d觀察各組小鼠關(guān)節(jié)處的病變情況，進(jìn)行小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：0=正常；1=踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；2=足掌、踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；3=足掌、踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4=足掌、踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹，伴有關(guān)節(jié)畸形或僵直。每只小鼠評分最高16分。

1.2.5樣本取材 于末次給藥后1 h，眼眶后靜脈取抗凝血，分離血漿用于細(xì)胞因子水平的檢測；加入淋巴細(xì)胞分離液，分離T淋巴細(xì)胞用于Th17/Treg細(xì)胞的檢測；分離脾臟單核細(xì)胞，進(jìn)行Th17/Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的檢測；取踝關(guān)節(jié)，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.6踝關(guān)節(jié)病理組織檢查[7]小鼠踝關(guān)節(jié)用4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣后，進(jìn)行石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)病理學(xué)變化，并分別從滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、骨質(zhì)侵蝕和炎癥程度進(jìn)行評分。①滑膜細(xì)胞增殖評分：0=無增殖；1=輕微增殖；2=中度增殖；3=過度增殖。②細(xì)胞侵蝕評分：0=無侵蝕；1=較少局部侵蝕；2=廣泛局部侵蝕；3=廣泛侵蝕到關(guān)節(jié)囊。③血管翳評分：0=無改變；1=兩個(gè)部位出現(xiàn)血管翳；2=四個(gè)部位出現(xiàn)血管翳，伴有軟骨表面的侵蝕；3=四個(gè)以上部位出現(xiàn)血管翳。④炎癥評分：0=正常；1=輕度炎癥；2=中度炎癥；3=重度炎癥。

1.2.7血漿IL-17、IL-10水平檢測 采用ELISA試劑盒，按照說明書要求，檢測血漿中IL-17、IL-10的水平。

1.2.8外周血Th17/Treg細(xì)胞的檢測 新鮮抗凝血采用淋巴細(xì)胞分離液分離得到淋巴細(xì)胞，用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，分別進(jìn)行Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的檢測。Th17細(xì)胞：加入細(xì)胞刺激劑刺激4 h，加入抗CD4-FITC抗體1 μL，避光孵育20 min，加PBS清洗2次，加破膜劑，避光孵育20 min，加破膜洗液清洗2次，加入抗IL-17A-PE抗體2 μL，避光孵育30 min，用破膜洗液清洗2次。Treg細(xì)胞：加入對應(yīng)抗CD4-FITC抗體1 μL，抗CD25-PE抗體2 μL，抗CD127-PE抗體2 μL，避光孵育30 min，加PBS清洗2次。上述處理后，均加入500 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例。

1.2.9流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟Th17/Treg細(xì)胞 無菌取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞，采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，以含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，6孔板中加入1 mL細(xì)胞懸液，分別進(jìn)行Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的檢測，方法同“1.2.8”。

1.2.10qPCR檢測CD4+T細(xì)胞中相關(guān)mRNA表達(dá) 無菌取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞，采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，將脾細(xì)胞重懸于IMagTMBuffer中(2×1011·L-1)，與CD4磁珠4 ℃避光孵育30 min，使用磁力架進(jìn)行磁性分離。TRIzol法提取CD4+T細(xì)胞RNA，檢測CD4+T細(xì)胞中IL-17、IL-10 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果以2-ΔΔCT表示。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR detection

2 結(jié)果

2.1 ZTF對CIA小鼠關(guān)節(jié)形態(tài)變化及病理組織學(xué)改變的影響如Fig 1A、1B所示，CIA小鼠于d 30，其四肢陸續(xù)出現(xiàn)紅腫，腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時(shí)間延長而升高，與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.01)；ZTF干預(yù)組小鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸下降，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。

如Fig 1C所示，正常對照組小鼠關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠滑膜細(xì)胞大量增生，滑膜組織中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，關(guān)節(jié)軟骨表面被破壞，炎性細(xì)胞侵蝕骨組織；ZTF組小鼠滑膜增生減少，滑膜組織中炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，骨破壞減少。病理評分結(jié)果顯示(Tab 2)，與正常對照組比較，模型組小鼠炎癥評分明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，ZTF組小鼠滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、骨質(zhì)侵蝕均明顯改善(P<0.05)，炎癥評分明顯降低(P<0.05)。提示ZTF能夠減輕CIA小鼠的關(guān)節(jié)病變程度。

2.2 ZTF對CIA小鼠血漿中IL-17、IL-10水平的影響如Fig 2所示，與正常對照組比較，模型組小鼠外周血IL-17水平明顯升高，IL-10水平明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，ZTF組小鼠外周血IL-17水平下降，IL-10水平上升(P<0.05)。提示ZTF能夠調(diào)節(jié)CIA小鼠外周血Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。

Fig 1 Effect of ZTF on ankle swelling, arthritis index and histopathological changes in CIA n=6)

A:Ankle swelling;B:Arthritis index;C:Histopathological changes(HE×100).*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel.

2.3 ZTF對CIA小鼠外周血Th17/Treg細(xì)胞比例的影響如Fig 3所示，與正常對照組比較，模型組小鼠外周血中Th17細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01)，Treg細(xì)胞比例明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，ZTF組小鼠外周血中Th17細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)，Treg細(xì)胞比例明顯上升(P<0.05)。提示ZTF能夠調(diào)節(jié)CIA小鼠外周血Th17/Treg細(xì)胞的平衡。

Tab 2 Effect of ZTF on pathological scoring of joint in CIA mice n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

A: Th17; B: Treg; C: Th17 frequency and Treg frequency.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel.

A: Th17; B: Treg; C: Th17 frequency and Treg frequency.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

Fig 5 Effect of ZTF on CD4+ T cell-associated cytokine mRNA expression in spleen of CIA mice n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.4 ZTF對脾臟Th17/Treg細(xì)胞比例的影響如Fig 4所示，與正常對照組比較，模型組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)，Treg細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，ZTF組小鼠脾臟Th17細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)，Treg細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。提示ZTF能夠調(diào)節(jié)CIA小鼠脾臟Th17/Treg細(xì)胞的平衡。

2.5 ZTF對脾臟CD4+T細(xì)胞IL-17、IL-10 mRNA的影響如Fig 5所示，CIA小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)；ZTF組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.05)。提示ZTF能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞中IL-17、IL-10 mRNA的表達(dá)。

3 討論

RA病理機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為RA的發(fā)生和發(fā)展受到遺傳、環(huán)境、感染、免疫等因素的影響，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫紊亂。復(fù)方用藥和整體調(diào)節(jié)是中醫(yī)藥的特色之一，通過合理配伍，可恢復(fù)機(jī)體的免疫平衡，發(fā)揮增效減毒的作用。ZTF是由國醫(yī)大師周仲瑛教授的清絡(luò)通痹方精簡而來，由養(yǎng)陰清熱(生地)、活血化瘀(炙僵蠶、三七)、祛風(fēng)除濕(雷公藤、青風(fēng)藤)3個(gè)功效單元組成。在前期大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步采用CIA小鼠驗(yàn)證ZTF對關(guān)節(jié)炎癥狀的改善作用，發(fā)現(xiàn)ZTF對CIA小鼠關(guān)節(jié)部位腫脹度、炎性因子浸潤、滑膜增生、骨破壞癥狀均有一定的改善作用，這與我們以前在其他RA動物模型中的觀察結(jié)果一致[8]，再次證實(shí)了ZTF對RA具有良好的治療作用。

CD4+T細(xì)胞作為機(jī)體重要的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，其在RA中的分化異常也日益受到關(guān)注[4]。臨床研究表明，RA患者的CD4+T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞的能力和對自身免疫調(diào)節(jié)的反應(yīng)力與健康人相比都存在異常[9]。CD4+T細(xì)胞在激活后能夠分化成不同的T細(xì)胞亞群，分泌不同的細(xì)胞因子，產(chǎn)生不同的功能。傳統(tǒng)研究認(rèn)為，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞之間的動態(tài)平衡能夠抑制RA的發(fā)生與發(fā)展，但隨著更多不同Th亞群的發(fā)現(xiàn)，單一的Th1/Th2細(xì)胞之間的關(guān)系并不能解釋RA的復(fù)雜機(jī)制，Th17/Treg細(xì)胞之間的失衡對RA病情的發(fā)展也具有重要影響。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17，其是一種強(qiáng)致炎因子，在濃度很低的情況下依然具有生物活性，且與受體存在很高的親和力[10]。IL-17能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤到關(guān)節(jié)滑膜，刺激成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生更多的促炎因子，并與IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)血管翳形成和關(guān)節(jié)軟骨破壞，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)炎癥[11]。Treg細(xì)胞能分泌IL-10，抑制TNF-α、IFN-γ等促炎因子的釋放，也能直接發(fā)揮組織修復(fù)能力，促進(jìn)機(jī)體的免疫耐受并維持免疫穩(wěn)態(tài)[12]。因此，本文觀察了ZTF對Th17和Treg細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，結(jié)果表明，CIA小鼠促炎性IL-17水平明顯升高，抑炎性IL-10水平明顯降低；而ZTF能夠降低IL-17的水平，升高IL-10的水平。

為了明確這些細(xì)胞因子水平的改變是否是由于ZTF調(diào)節(jié)了Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的平衡，本研究檢測了CIA小鼠外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZTF可以升高CIA小鼠外周血Treg細(xì)胞比例，降低Th17細(xì)胞比例，逆轉(zhuǎn)Th17和Treg細(xì)胞分化的失平衡。由于脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，是T淋巴細(xì)胞儲存和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場所，也是調(diào)控機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的重要器官，本研究也檢測了脾臟中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，CIA小鼠脾臟Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化與外周血一致，提示Th17/Treg失平衡在RA外周和免疫器官中同時(shí)存在，而ZTF對外周和免疫器官中Th17/Treg的失平衡均有改善作用。本文進(jìn)一步檢測脾臟CD4+T細(xì)胞中IL-17、IL-10 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZTF可以逆轉(zhuǎn)IL-17、IL-10 mRNA的異常表達(dá)，提示ZTF可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞動態(tài)平衡，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，進(jìn)而對RA起到一定的防治效應(yīng)。然而，Th17/Treg細(xì)胞的分化平衡具有明顯的可塑性，除初始分化外，Th17細(xì)胞受環(huán)境因素影響，可分化為Th1細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化成Treg細(xì)胞[13-14]；Treg細(xì)胞在相關(guān)信號蛋白和細(xì)胞因子作用下，能轉(zhuǎn)分化為Th1、Th2樣細(xì)胞或Th17細(xì)胞[15]。因此，下一步研究除進(jìn)一步明確ZTF不同功效單元調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞分化的具體靶點(diǎn)和機(jī)制外，還應(yīng)關(guān)注再分化的平衡，這將有利于揭示ZTF重建RA免疫平衡的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為臨床合理組方用藥提供理論依據(jù)。

綜上所述，滋腎通絡(luò)方以養(yǎng)陰清熱、活血化瘀、祛風(fēng)除濕為原則，能夠明顯延緩RA的發(fā)生與發(fā)展，其機(jī)制與調(diào)節(jié)RA的Treg/Th17細(xì)胞分化及平衡，從而調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌密切相關(guān)。