張 飛，劉振國，王海芳，武祥龍，劉 柳，藺旭彬，呂文君，劉 浩

(1. 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710072；2. 陜西省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710068；3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 712046)

癌癥的明顯特征是腫瘤細(xì)胞不受控制和不規(guī)則的增殖，并且細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂過程嚴(yán)重紊亂。腫瘤在機(jī)體內(nèi)不停地轉(zhuǎn)移和侵襲，正常組織被嚴(yán)重破壞，最終導(dǎo)致機(jī)體的死亡[1]。面對(duì)癌癥發(fā)病率逐年增加，加快抗腫瘤新藥的研究迫在眉睫[2]。因此，發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物并研究其作用機(jī)制，具有十分重要的意義。

利魯唑，化學(xué)名為2-氨基-6-三氟甲氧基苯并噻唑(Fig 1，化合物1)，目前用于治療側(cè)索硬化癥。韓國和美國學(xué)者分別發(fā)現(xiàn)了利魯唑?qū)θ烁伟┘?xì)胞和乳腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用[3-4]。本課題組主要從事利魯唑衍生物的鎮(zhèn)痛研究[5-7]，并且已經(jīng)合成了12種利魯唑衍生物[8]，經(jīng)過SciFinder查新發(fā)現(xiàn)，其中2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑(Fig 1，化合物4)是新化合物。關(guān)于其藥理活性作用有待研究，本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞增殖、凋亡和遷移實(shí)驗(yàn)，研究化合物4的抗腫瘤活性。

Fig 1 Structure of riluzole(1) and

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 小鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞系、小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞系，人宮頸癌HeLa細(xì)胞系、人肝癌HepG2細(xì)胞系、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，源自于本學(xué)院細(xì)胞種子庫。

1.1.2藥物與試劑 2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑?yàn)楸菊n題組合成，純度99.9%。培養(yǎng)基α-MEM、RPMI 1640、DMEM，購自HyClone公司；胎牛血清，購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒，購自南京恩晶生物科技有限公司；Hoechst 33258、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；索拉非尼，購自濟(jì)南晟齊醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3儀器 Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Nikon 80i正置熒光顯微鏡(尼康儀器上海有限公司)；Olympus CKX41倒置式生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)。

1.2 方法

1.2.1CCK-8法測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2、HeLa、MCF-7、MC3T3-E1貼壁細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)；對(duì)于半貼壁細(xì)胞SP2/0直接吹打離心，棄上清液，加入培養(yǎng)液吹打計(jì)數(shù)。以每孔2.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，加入含有不同濃度2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑的培養(yǎng)液，使其終濃度為1.23、3.7、11.11、33.33、100 μmol·L-1，空白溶劑為對(duì)照組。孵育48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，再孵育2 h，測(cè)定450 nm時(shí)吸光度值，根據(jù)公式：增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及IC50值[9]。

1.2.2毒性選擇性指數(shù)的計(jì)算方法 采用毒性選擇性指數(shù)(selectivity index，SI)來衡量化合物的安全性。計(jì)算公式為：某化合物的SI值=化合物對(duì)正常細(xì)胞的IC50值/化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值。SI值表示某個(gè)化合物可以抑制腫瘤細(xì)胞，但不損害正常細(xì)胞，當(dāng)SI值大于1時(shí)，表示該化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性大于對(duì)正常細(xì)胞的毒性；當(dāng)SI值大于3時(shí)，表明該化合物的選擇性比較好，SI值越大表明化合物的抗腫瘤活性越好，對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性越小[10]。

1.2.3Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板內(nèi)的蓋玻片上，培養(yǎng)24 h，然后加入含有不同濃度藥物(終濃度為12.5、25、50 μmol·L-1)的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，固定10 min，用PBS洗滌3次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，孵育5 min，再用PBS洗滌3次。將蓋玻片轉(zhuǎn)移至載玻片上，封片。激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm條件下，熒光拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)[11]。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔5×105個(gè)。培養(yǎng)24 h，加入含有不同濃度藥物(終濃度為12.5、25、50 μmol·L-1)的培養(yǎng)液。藥物作用24 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌，消化，按試劑盒說明書步驟操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)貼壁腫瘤細(xì)胞的遷移能力，是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法。以每孔5×105個(gè)細(xì)胞將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。用1 mL槍頭在孔內(nèi)沿直徑方向畫粗細(xì)均勻的1條豎線，PBS洗掉劃下的細(xì)胞和碎片，在光學(xué)顯微鏡下拍照記錄給藥前的劃痕情況。加入含有藥物的培養(yǎng)液，終濃度為25 μmol·L-1，孵育24 h，再次拍照記錄劃痕狀態(tài)[12]。計(jì)算劃痕的相對(duì)愈合率，公式為：劃痕的相對(duì)愈合率=(0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度)/0 h的劃痕寬度×100%。

2 結(jié)果

2.1 化合物4對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的化合物4(1.23、3.7、11.11、33.33、100 μmol·L-1)對(duì)HeLa、HepG2、MCF-7、SP2/0細(xì)胞增殖的影響，取藥物濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)。由Fig 2可見，隨著濃度的增加，化合物4對(duì)4種腫瘤細(xì)胞增殖抑制率均明顯增加，尤其對(duì)MCF-7細(xì)胞作用最明顯，在濃度較低時(shí)就表現(xiàn)出很好的增殖抑制作用。

Fig 2 Proliferation inhibitory rate to HeLa,HepG2,

根據(jù)不同濃度下增殖抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值，索拉非尼作為陽性對(duì)照。由Tab 1可見，化合物4對(duì)4種細(xì)胞均有一定的抑制作用，其中對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2和MCF-7抑制作用接近陽性對(duì)照的作用效果。選取MC3T3-E1研究藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，計(jì)算其IC50值，以此為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算藥物對(duì)不同腫瘤的SI值?；衔?對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的SI值均大于1，表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性大于對(duì)正常細(xì)胞的毒性。而對(duì)于HepG2和MCF-7的SI值都大于3，充分說明其對(duì)HepG2和MCF-7細(xì)胞具有較好的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞毒性小。

2.2 化合物4對(duì)MCF-7細(xì)胞的促凋亡作用根據(jù)細(xì)胞毒性篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物4對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制效果最明顯，故選用MCF-7作為研究對(duì)象，采用Hoechst 33258染色，觀察化合物4對(duì)MCF-7細(xì)胞核形態(tài)的影響。由Fig 3可見，空白對(duì)照細(xì)胞呈現(xiàn)完整的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，具有圓形飽滿的細(xì)胞核，且顏色較暗。藥物濃度增加到25 μmol·L-1時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞核致密濃染的狀態(tài)，細(xì)胞核顏色呈現(xiàn)亮白狀態(tài)，這是細(xì)胞凋亡的典型特征。當(dāng)濃度為50 μmol·L-1時(shí)，可以看到細(xì)胞核近似破裂，分散在胞質(zhì)中，說明細(xì)胞已經(jīng)凋亡。形態(tài)學(xué)結(jié)果表明化合物4能使細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制了細(xì)胞的增殖。

Tab 1 IC50 value and selectivity

Fig 3 Hoechst 33258 staining of MCF-7 cells treated by different drug concentrations for 24 h

Fig 4 Apoptosis of MCF-7 cells treated by different concentrations of compound 4 detected by flow cytometry

細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)是癌癥治療過程中的重要靶標(biāo)，抗腫瘤藥物可以誘導(dǎo)和促進(jìn)其凋亡[13]。采用Annexi V-FITC和PI雙染法研究化合物4對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，由Fig 4可見，空白組MCF-7細(xì)胞的存活率高達(dá)99.9%，說明在沒有藥物時(shí)，MCF-7細(xì)胞不受影響，正常生長。當(dāng)藥物濃度為12.5 μmol·L-1時(shí)，早期凋亡細(xì)胞比例為13.84%；當(dāng)濃度為25 μmol·L-1時(shí)，早期凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加到25.54%；當(dāng)給藥濃度增加到50 μmol·L-1時(shí)，早期凋亡細(xì)胞的比例增加到41.17%?？梢?，早期凋亡率隨著化合物4濃度增加而增大，并且早期凋亡率均大于壞死率，說明化合物4具有誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞早期凋亡的能力，并且具有濃度依賴關(guān)系。

2.3 抗遷移實(shí)驗(yàn)研究如Fig 5所示，對(duì)照組細(xì)胞劃痕寬度愈合程度高，而給藥組的劃痕寬度變化不明顯?？瞻捉M的劃痕愈合率高達(dá)75%，給藥組劃痕愈合率只有16%，說明化合物4對(duì)MCF-7細(xì)胞具有一定的抗遷移能力。

Fig 5 Effect of compound 4 on migration

**P<0.01vscontrol

3 討論

利魯唑具有一定的抗腫瘤作用，本課題組設(shè)想其衍生物可能也具有抗腫瘤作用，因此，合成了2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑，并研究其抗腫瘤作用和機(jī)制。采用CCK-8法分析了該化合物對(duì)HeLa、HepG2、MCF-7、SP2/0細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)其可以抑制這4種腫瘤細(xì)胞的增殖，作用效果沒有超過陽性對(duì)照索拉非尼。該化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值最接近陽性對(duì)照，作用效果最明顯，所以，采用MCF-7細(xì)胞深入研究了化合物抗腫瘤作用機(jī)制。

Hoechst染色是一種可以直接觀察細(xì)胞凋亡的方法，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色物質(zhì)會(huì)固縮。在熒光顯微鏡下可以觀察到，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)致密濃染狀態(tài)，或者呈現(xiàn)碎塊狀的致密濃染，顏色發(fā)白，而正常細(xì)胞核則呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色。通過Hoechst 33258染色可見，化合物4濃度增加時(shí)，有明顯的細(xì)胞核濃染，說明化合物4可以使腫瘤細(xì)胞凋亡。

單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典且操作簡單的研究細(xì)胞遷移能力的體外實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕寬度，可直觀看出細(xì)胞遷移情況。相對(duì)劃痕愈合率可以定量說明細(xì)胞遷移能力，遷移率越大，表明細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)，反之，遷移能力越弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，化合物4作用后的遷移率只有16%，而對(duì)照組的遷移率為75%，說明化合物4可以抑制細(xì)胞的遷移。

藥物使細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制是復(fù)雜多樣的，本研究通過流式細(xì)胞分析法，獲得凋亡過程中細(xì)胞數(shù)量占比，分析細(xì)胞凋亡的原因。結(jié)果提示，隨著藥物濃度增加，早期凋亡細(xì)胞比率逐漸增加，表明化合物通過誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡而發(fā)揮作用。在單層實(shí)驗(yàn)中，濃度是一個(gè)關(guān)鍵因素，濃度太低時(shí)，無法觀察到抗遷移效果，濃度太高會(huì)使絕大多數(shù)細(xì)胞凋亡而無法形成細(xì)胞層。結(jié)合IC50值，經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究選取了化合物4濃度25 μmol·L-1開展研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法篩選了2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑?qū)?種腫瘤細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)4種腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性和良好的選擇性，尤其是對(duì)MCF-7細(xì)胞作用效果最明顯。2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑還可以改變MCF-7細(xì)胞核形態(tài)，明顯抑制其遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞的早期凋亡，本研究為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

(致謝：本研究是在西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院完成，衷心感謝各位老師和同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過程中的幫助與指導(dǎo)！)