張偉云，劉華欣，王 青，陳全成

(1. 廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023；2. 廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門 361102)

糖尿病是一種多因素引起的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，可分為1型、2型、妊娠糖尿病和其它特殊類型糖尿病[1]。胰島素抵抗和高血糖是2型糖尿病的主要特征，器官減少對葡萄糖的攝取、代謝[2]。因此，尋找胰島素增敏劑來對抗胰島素抵抗，從而治療2型糖尿病[3]。噻唑烷二酮(thiazolidinedione，TZD)介導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的激活，導(dǎo)致胰島素敏感性明顯提高[4-5]。PPARγ對葡萄糖、脂質(zhì)代謝和炎癥過程發(fā)揮較大作用[6-7]。PPARγ對胰島素應(yīng)答性葡萄糖攝取和增強葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達(dá)有重要意義[8-9]。PPARγ2在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，且促進(jìn)分化[10]。3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化后，得到的新的成熟脂肪細(xì)胞能加快對葡萄糖的吸收。胰島素或胰島素類似物在培養(yǎng)基中與細(xì)胞內(nèi)不同的酶和受體作用，可以激活細(xì)胞和細(xì)胞核中的許多信號通路，從而進(jìn)一步促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞攝取、運輸、消耗葡萄糖，最終使細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低。綜上所述，3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型已被用于降血糖活性篩選[11-12]。

澤瀉[Alismaorientale(Sam.) Juzep.]利水滲濕、泄熱、化濁降脂，現(xiàn)代研究表明，澤瀉水、醇提物均可改善高脂飼喂小鼠胰島素抵抗模型的糖耐量[13]，但具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉中的特征成分之一，屬于化學(xué)結(jié)構(gòu)分類中三萜類化合物，具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取活性[13]。因此，本研究旨在探索23-乙酰澤瀉醇B是否具有抗糖尿病的潛力。采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和煙酰胺腹腔注射誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型[14]，測定23-乙酰澤瀉醇B降低血糖活性；應(yīng)用3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收模型，檢測23-乙酰澤瀉醇B對葡萄糖吸收的影響；通過3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型，評估23-乙酰澤瀉醇B對分化的作用和改善胰島素抵抗的能力。在本研究中使用TZD類中的羅格列酮作為陽性對照藥。

1 材料

1.1 藥物與試劑胰島素、葡萄糖、STZ、煙酰胺、羅格列酮、油紅O染色和Harris蘇木精染色液，購自美國Sigma-Aldrich公司；23-乙酰澤瀉醇B(C32H50O5，純度>98%)，購自成都瑞芬思有限公司；葡萄糖熒光示蹤劑2-[N-(7-硝基苯-2-氧代-1，3-重氮基-4-基)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG)，購自美國Molecular Probes公司；其他化學(xué)試劑均為分析級。

1.2 實驗動物5～6周齡C57BL/6 ♂小鼠，體質(zhì)量20～23 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證號為2015000501745。每籠隨機8只，飼養(yǎng)在室溫(22±2)℃、濕度(50±5)%和12 h/12 h明暗光循環(huán)條件下。適應(yīng)2周后，按照國家動物實驗標(biāo)準(zhǔn)開始實驗。

1.3 細(xì)胞3T3-L1前脂肪細(xì)胞，購自美國菌種保存中心。

1.4 儀器血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

2 方法

2.1 2型糖尿病模型的建立♂ C57BL/6小鼠禁食，次日腹腔注射240 mg·kg-1煙酰胺，15 min后腹腔注射100 mg·kg-1STZ，2 d后再次注射相同劑量的煙酰胺和STZ。3周后，與空白對照組相比，血糖明顯升高則可證實已造成高血糖，2型糖尿病模型成功建立。每日稱量，并記錄建模期間和灌胃給藥期間小鼠體質(zhì)量。

2.2 測定血糖值腹腔注射煙酰胺和STZ后，每7 d 采血(5～10 μg)1次，即分別在d 0(注射前)、7、14、21，用血糖測定儀測定血糖濃度。

2.3 口服葡萄糖耐受試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)小鼠注射STZ和煙酰胺后的d 21禁食過夜，d 22進(jìn)行OGTT。2型糖尿病模型組、陽性對照藥羅格列酮組及23-乙酰澤瀉醇B不同劑量組分別按小鼠體質(zhì)量給予生理鹽水、10 mg·kg-1羅格列酮、23-乙酰澤瀉醇B(5、10、20 mg·kg-1)2 h后，再灌胃葡萄糖溶液(2.0 g·kg-1)。第0 min和灌胃葡萄糖后的第30、60、120 min尾靜脈收集血液，并測定血糖水平。

2.4 灌胃給予23-乙酰澤瀉醇B對空腹血糖和OGTT的影響空白對照組和模型組小鼠每日灌胃生理鹽水、陽性對照組灌胃羅格列酮10 mg·kg-1，試藥組分別灌胃23-乙酰澤瀉醇B(5、10、20 mg·kg-1)，持續(xù)3周。在d 0和給藥后d 7、14、21，測定各組小鼠血糖值，小鼠在灌胃后的d 21禁食過夜，于d 22進(jìn)行OGTT。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，第5～9代的細(xì)胞用于實驗。

2.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞葡萄糖吸收情況參照文獻(xiàn)[11]測定23-乙酰澤瀉醇B對葡萄糖吸收的影響。每孔1×104個細(xì)胞將分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞接種到96孔板培養(yǎng)24 h后，再用含30 mmol·L-1D-葡萄糖(高糖條件)和1 μmol·L-1胰島素的無血清DMEM培養(yǎng)，對照組不加任何藥物處理，陽性對照組和試藥組分別用羅格列酮(1、10 μmol·L-1)和23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)與10 μmol·L-12-NBDG處理1 h后，收集細(xì)胞，并懸浮在500 μL預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基中，在4 ℃條件下待流式細(xì)胞儀分析。記錄流式細(xì)胞儀FL1通道中每組細(xì)胞的葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG的熒光強度。用羅格列酮(1、10 μmol·L-1)、23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)不加10 μmol·L-12-NBDG的條件下單獨處理細(xì)胞1 h，作為背景值，以避免假陽性。相對熒光強度減去背景值用于數(shù)據(jù)分析。

2.7 油紅O染色參照文獻(xiàn)方法[11]，首先將3T3-L1前脂肪細(xì)胞按4×103細(xì)胞/孔接種到96孔板中培養(yǎng)24 h，然后換成含10%胎牛血清和1 μmol·L-1胰島素的DMEM培養(yǎng)基，對照組不加任何藥物處理，陽性對照組加入羅格列酮(1、10 μmol·L-1)培養(yǎng)3 d，23-乙酰澤瀉醇B組加入23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)培養(yǎng)3 d。細(xì)胞培養(yǎng)12 d后，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定1 h，依次用油紅O溶液2 h、Harris蘇木精染色液染色15 min后，用60%異丙醇清洗3次，將未與細(xì)胞結(jié)合的染料移除，最后于顯微鏡下(×400)拍攝染色情況。

3 結(jié)果

3.1 2型糖尿病小鼠模型造模后的空腹血糖值、OGTT、體質(zhì)量變化在腹腔注射煙酰胺和STZ后的d 21，小鼠的血糖值明顯高于空白對照組小鼠血糖值，提示造模成功。d 22對模型組和空白對照組進(jìn)行OGTT，2型糖尿病模型小鼠灌胃葡萄糖溶液后的第30、60、120 min對應(yīng)的血糖值，均明顯高于空白對照組，提示造模成功。2型糖尿病模型建立期間，模型組、空白對照組的小鼠體質(zhì)量差異無顯著性。

3.2 23-乙酰澤瀉醇B對2型糖尿病小鼠血糖的影響陽性對照組每日灌胃羅格列酮10 mg·kg-1，d 7、14、21的血糖值與2型糖尿病模型組相比明顯降低。每日按小鼠體質(zhì)量分別灌胃23-乙酰澤瀉醇B(5、10 mg·kg-1)，持續(xù)給藥3周，在給藥后的d 7、14、21，與2型糖尿病模型組小鼠相比，血糖值呈明顯下降的趨勢(Fig 1)。23-乙酰澤瀉醇B 10 mg·kg-1劑量組比5 mg·kg-1組顯示出更好的降血糖活性，而20 mg·kg-1劑量組降血糖趨勢并未比10 mg·kg-1劑量組明顯。

Fig 1 Effect of alisol B 23-acetate atdifferent doses on blood

**P<0.01vstype 2 diabetic model group;##P<0.01vsblank control group

3.3 23-乙酰澤瀉醇B對2型糖尿病小鼠OGTT過程中血糖的影響與模型組比較，羅格列酮10 mg·kg-1組使2型糖尿病小鼠在OGTT中第30、60 min的血糖值明顯降低，而23-乙酰澤瀉醇B(5、10、20 mg·kg-1)組在OGTT中僅在一定程度上對血糖值呈現(xiàn)出降低的趨勢(Fig 2)。

3.4 23-乙酰澤瀉醇B對脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的影響為研究23-乙酰澤瀉醇B在高糖(30 mmol·L-1)條件下，是否提高葡萄糖吸收，采用分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型進(jìn)行葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG吸收實驗。羅格列酮(1、10 μmol·L-1)在高糖條件下明顯增加胰島素刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞對2-NBDG的吸收。23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)也明顯提高了胰島素介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞對2-NBDG的吸收。23-乙酰澤瀉醇B(10 μmol·L-1)促進(jìn)脂肪細(xì)胞吸收2-NBDG的活性與陽性對照藥羅格列酮相似(Fig 3)。提示在高濃度葡萄糖環(huán)境下，23-乙酰澤瀉醇B提高分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞吸收胰島素刺激的2-NBDG活性。

Fig 2 Effect of alisol B 23-acetate at

*P<0.05vstype 2 diabetic model group;##P<0.01vsblank control group

Fig 3 Effect of alisol B-23-acetate oninsulin-stimulated glucose uptake in adipocytesunder high concentration glucose

**P<0.01vscontrol(2-NBDG and insulin co-treated high-concentration glucose group)

3.5 23-乙酰澤瀉醇B對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響油紅O染料可與細(xì)胞中的甘油三酯反應(yīng)，使脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。大量的脂肪滴出現(xiàn)在細(xì)胞中，表明新的成熟脂肪細(xì)胞的形成。如Fig 4所示，與對照組相比，23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)和羅格列酮(1、10 μmol·L-1)均能促進(jìn)分化。

Fig 4 Effect of alisol B 23-acetate on differentiation in 3T3-L1 pre-adipocytes(×400)

A: Pre-adipocytes; B: Control cells (differentiated 3T3-L1 adipocytes); C: 1 μmol·L-1rosiglitazone; D: 10 μmol·L-1rosiglitazone; E: 1 μmol·L-1alisol B 23-acetate; F: 10 μmol·L-1alisol B 23-acetate.

4 討論

灌胃澤瀉乙酸乙酯提取物降低2型糖尿病小鼠空腹血糖值和口服葡萄糖耐量實驗期間的血糖值，但具體的有效成分尚不明確[15]。研究表明，澤瀉三萜類成分23-乙酰澤瀉醇B具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取活性[13]，很可能是其降糖藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此，本實驗探討了澤瀉的特征化學(xué)成分23-乙酰澤瀉醇B對2型糖尿病小鼠降糖活性的影響。模型組空腹血糖值和OGTT期間血糖明顯高于空白對照組，提示造模成功。羅格列酮10 mg·kg-1給藥21 d后的血糖值明顯低于2型糖尿病組小鼠；23-乙酰澤瀉醇B(5、10、20 mg·kg-1)組給藥3周后，與模型組相比，也降低了血糖值。進(jìn)行OGTT以確認(rèn)對胰島素的敏感性，2型糖尿病模型組小鼠在灌胃葡萄糖溶液后的第30、60、120 min時，血糖值明顯高于空白對照組。羅格列酮10 mg·kg-1組在OGTT的第30、60 min時，使2型糖尿病小鼠血糖值下降, 23-乙酰澤瀉醇B組也在第30、60 min對血糖值有一定程度的降低。以上結(jié)果提示，23-乙酰澤瀉醇B和羅格列酮均可降低OGTT期間的血糖值，提示二者均能使胰島素抵抗程度降低。因此，23-乙酰澤瀉醇B降低血糖值，可一定程度地改善胰島素抵抗。

23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)均能明顯促進(jìn)脂肪細(xì)胞吸收胰島素刺激的葡萄糖，提示23-乙酰澤瀉醇B可能作為治療2型糖尿病的候選藥物，但其作用機制尚需深入研究。

在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型中，23-乙酰澤瀉醇B(1、10 μmol·L-1)均能促進(jìn)分化過程。在分化過程中，產(chǎn)生新的成熟的脂肪細(xì)胞可能與胰島素或胰島素類似物作用，從而激活細(xì)胞和細(xì)胞核中的信號通路，增強成熟脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收。因此，推測23-乙酰澤瀉醇B降血糖活性、提高糖吸收可能與其促進(jìn)分化有關(guān)。

本文報道了23-乙酰澤瀉醇B的降血糖活性，提示23-乙酰澤瀉醇B可能是澤瀉降血糖作用的藥效物質(zhì)。綜合23-乙酰澤瀉醇B促進(jìn)分化、提高糖吸收、降低2型糖尿病小鼠空腹血糖值和OGTT過程中的血糖值的結(jié)果分析，推測23-乙酰澤瀉醇B的降血糖活性可能是由于其激活PPARγ，并增加其在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化，提高胰島素敏感性，從而促進(jìn)胰島素應(yīng)答性葡萄糖吸收和改善胰島素抵抗，最終使葡萄糖濃度降低。然而，上述推測尚需進(jìn)一步研究和驗證，詳細(xì)的藥理作用及作用機制尚需深入研究。