孫忠人，田洪昭，徐思禹，趙健宏，欒逸先，張文釗，尹洪娜

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

每年有多達(dá)50萬(wàn)人罹患脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)，對(duì)于他們來(lái)說(shuō)，傷害將會(huì)改變一生，脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分,周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)纖維從它發(fā)出，向肌肉和器官傳遞信號(hào)，使人們能夠運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)到熱和疼痛，但與周圍神經(jīng)不同，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后很難恢復(fù)[1]。所以對(duì)于脊髓損傷后的治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題。但中醫(yī)治療體現(xiàn)了特殊優(yōu)勢(shì)，電針廣泛應(yīng)用于多種疾病的輔助治療，尤其是脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。但其分子生物學(xué)機(jī)制并不十分明確。綜述近年學(xué)者們對(duì)電針治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)機(jī)制研究文獻(xiàn)，總結(jié)電針治療SCI的分子生物學(xué)機(jī)制，綜述如下。

1 電針促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)

1.1 促進(jìn)軸突再生

1.1.1 電針抑制軸突生長(zhǎng)抑制因子表達(dá) 在抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)中，幾種髓鞘成分，包括Nogo-A(Nogo-66)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)和髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，通過(guò)相同的Nogo受體(NgR)發(fā)揮作用[2]。研究證明電針在治療脊髓損傷時(shí)降低Nogo-A、NgR、OMgp的表達(dá)[3-4]，說(shuō)明電針可以抑制軸突生長(zhǎng)抑制因子的含量，從而促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)，進(jìn)而改善大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能。

1.1.2 電針減少膠質(zhì)瘢痕的形成 膠質(zhì)瘢痕的主要細(xì)胞成分是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(以膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP為主要標(biāo)志物)。膠質(zhì)瘢痕是軸突再生的物理和分子屏障，抑制損傷軸突再生，并已成為脊髓損傷再生研究的重要靶標(biāo)[5]。BMP-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白，能夠增強(qiáng)星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生，促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成，抑制神經(jīng)再生并阻止神經(jīng)功能的恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)電針降低脊髓損傷GFAP和BMP-2表達(dá)量，改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能[6-7]。

1.1.3 電針促進(jìn)軸突再髓鞘化 SCI后會(huì)出現(xiàn)軸突脫髓鞘的病理改變，促進(jìn)軸突再髓鞘化有利于修復(fù)神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)功能，促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)。少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌的髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein，MBP)是軸突再髓鞘化的重要蛋白。電針能升高損傷脊髓細(xì)胞MBP表達(dá)，增進(jìn)軸突再髓鞘化，改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能[8]。

1.2 促進(jìn)神經(jīng)元再生

1.2.1 電針促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化 在成年哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstem cells，NSCs)在受損情況下具有分化功能，可分化成神經(jīng)元[9]。電針可促進(jìn)SCI后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分化和神經(jīng)纖維的再生，使神經(jīng)纖維再生和部分功能恢復(fù)[10]。巢蛋白(nestin)是神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白。電針可以升高巢蛋白的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[6]。

1.2.2 電針促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng) 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)是參與神經(jīng)元生長(zhǎng)和突觸再生的胞膜磷酸蛋白質(zhì)，是中樞神經(jīng)再生的標(biāo)志性蛋白。電針促進(jìn)GAP-43表達(dá)增高可以促進(jìn)錐體再生和突觸形成，重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路[11]。

2 電針抑制細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化包括染色質(zhì)凝聚，核膜破裂，細(xì)胞皺縮和細(xì)胞表面附近的小泡囊體的形成，稱為凋亡小體[12]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷病理機(jī)制之一[13]，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可有效促進(jìn)損傷脊髓恢復(fù)。李曉寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，夾脊電針可以在治療3天時(shí)明顯抑制大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且隨著治療時(shí)間的增加抑制凋亡的作用越明顯，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能也隨著治療時(shí)間的增加而明顯恢復(fù)。有學(xué)者研究,電針能通過(guò)增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、抑制促凋亡蛋白Caspase-3、Bax、PARP的表達(dá)，從而抑制脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[15]。尹洪娜等[16-17]研究夾脊電針可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子Caspase-12、CHOP，從而抑制細(xì)胞凋亡。

3 電針改善損傷區(qū)域微環(huán)境

3.1 電針抑制炎癥反應(yīng)

在脊髓繼發(fā)性損傷階段浸潤(rùn)性白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)和先天免疫細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)活化引起損傷區(qū)全面炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些炎癥細(xì)胞大量釋放促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等)和趨化因子(CXCL1，CXCL12等)，導(dǎo)致軸突和神經(jīng)元的損傷[18]。巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞是脊髓損傷部位的重要效應(yīng)細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記可將巨噬細(xì)胞分為M1亞型和M2亞型，CD86和CD206分別針對(duì)M1和M2亞型。M1型巨噬細(xì)胞在創(chuàng)傷急性反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)增加吞噬功能和釋放促炎細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素1L-1β、IL-6和TNF-α)，促進(jìn)天然免疫，清除損傷部位的外來(lái)微生物和傷口碎片。M2型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出組織修復(fù)特性并減弱促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)抑炎因子1L-10的分泌[19-21]。在脊髓損傷中，炎癥免疫反應(yīng)可以說(shuō)是一把雙刃劍，對(duì)于M1和M2型巨噬細(xì)胞尤其如此，一般來(lái)說(shuō)，M1是有害的，而M2是保護(hù)性的。調(diào)節(jié)M1和M2巨噬細(xì)胞的極化可能影響炎癥應(yīng)答[22-23]。電針可以抑制M1巨噬細(xì)胞極化，顯著降低CD86的表達(dá),抑制促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的分泌，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，顯著升高CD206的表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子IL-10的分泌，減輕炎癥反應(yīng)[24]。危險(xiǎn)信號(hào)是許多常見(jiàn)炎癥疾病的標(biāo)志，這些刺激可以激活細(xì)胞內(nèi)天然免疫信號(hào)受體NLRP3，一旦激活，NLRP3就開(kāi)始組裝炎性體，導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)介導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)細(xì)胞因子家族的蛋白水解活化，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡[25]。有研究表明NLRP3炎性體是小鼠脊髓繼發(fā)性損傷的重要原因[26]。而夾脊電針可以降低NLRP3的表達(dá)，改善損傷脊髓區(qū)的微環(huán)境，利于大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[27]。

3.2 電針抑制興奮性氨基酸毒性

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要興奮性遞質(zhì)，當(dāng)其在突觸間隙中的濃度異常增加時(shí)可能產(chǎn)生細(xì)胞損傷[28]，在脊髓損傷時(shí)，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸被釋放并保留在突觸間隙中，引起突觸后神經(jīng)元中的鈣進(jìn)入和去極化，這些神經(jīng)元持續(xù)暴露于興奮性毒性狀態(tài)[29]。N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是一種離子型谷氨酸受體，其過(guò)度刺激增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和神經(jīng)元興奮性毒性[30]。Tu WZ等[31]應(yīng)用督脈電針減低脊髓損傷后NMDA 受體亞單位NR1和NR2蛋白表達(dá)，減輕神經(jīng)元興奮性氨基酸毒性，促進(jìn)大鼠后肢功能恢復(fù)。

3.3 電針抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)

脊髓損傷后，活性氧簇(ROS)大量積聚，清除能力不足，過(guò)量的活性氧簇啟動(dòng)不飽和脂肪酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞神經(jīng)元細(xì)胞膜，稱為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。其中丙二醛(MDA)是過(guò)氧脂質(zhì)的代謝產(chǎn)物, 超氧化物歧化酶(SOD)是自由基的清除劑。電針降低MDA的含量、升高SOD的含量，從而抑制脊髓組織的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[32]。

3.4 電針促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類與伸進(jìn)元存活密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子被鑒定為神經(jīng)元存活的啟動(dòng)子，但人們認(rèn)識(shí)到它們對(duì)神經(jīng)元發(fā)育和功能的許多方面都有調(diào)節(jié)作用，包括突觸形成和突觸可塑性。在哺乳動(dòng)物中表達(dá)4種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4(NT-4)[33]。脊髓損傷后神經(jīng)元受損，因此，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和脊髓損傷功能恢復(fù)密切相關(guān)[34]。督脈電針對(duì)NT-3、NGF和BDNF有上調(diào)作用[34-35]，證明電針可以促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌，防止脊髓組織神經(jīng)元的大量死亡，有利于大鼠后肢功能康復(fù)。

表1 電針作用機(jī)制及相關(guān)因子變化

3.5 電針增加血流量，改善微循環(huán)

血小板活化因子(PAF)在SCI時(shí)大量增加，促進(jìn)損傷區(qū)和臨近組織微血管血栓的形成，同時(shí)刺激微血管收縮，導(dǎo)致血流量的減少[36]。王延雷等[37]研究督脈電針抑制PAF的釋放，促進(jìn)脊髓血流量增加，修復(fù)損傷脊髓，吳永剛等[38]研究在脊髓損傷早起，損傷區(qū)脊髓血流量(SCBF)逐漸下降，24 h后逐漸恢復(fù)，應(yīng)用夾脊電針治療后，在2 h、4 h、8 h時(shí)明顯增加損傷區(qū)血流量，在4 h時(shí)最為明顯，說(shuō)明電針在SCI后2～8 h影響脊髓血流量。

3.6 電針促進(jìn)自噬流

自噬流包含了整個(gè)自噬過(guò)程，包括了自噬結(jié)構(gòu)的形成，底物向溶酶體的運(yùn)送，以及底物的降解和大分子物質(zhì)釋放回細(xì)胞質(zhì)的整個(gè)流程[39]。LC3-II是自噬體的標(biāo)記蛋白，p62是一種銜接蛋白，可將泛素化的蛋白導(dǎo)向自噬體進(jìn)行降解。隨著p62與其蛋白一起降解，當(dāng)自噬通量增加時(shí)，其蛋白質(zhì)水平降低；相反，當(dāng)自噬流被抑制時(shí)，p62水平增加。急性挫傷SCI大鼠LC3-II和p62的伴隨積累，表明自噬流的抑制[40]。夾脊電針可以升高LC3-II的含量，降低p62蛋白含量，增加脊髓組織自噬流，從而控制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[41]。

4 小結(jié)

電針促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)在臨床中已經(jīng)得到證實(shí)，患者往往在慢性期就診進(jìn)行電針治療，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中電針在急性期治療有不錯(cuò)的效果，可以多嘗試在臨床中應(yīng)用。臨床中常用的電針手法有督脈電針和夾脊電針。其治療脊髓損傷的分子機(jī)制主要為促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善脊髓損傷區(qū)域微環(huán)境。促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)包括抑制軸突生長(zhǎng)抑制因子的表達(dá)，減少瘢痕組織的形成，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化和神經(jīng)元再生。改善脊髓損傷區(qū)域微環(huán)境包括抑制損傷區(qū)域免疫炎性反應(yīng)、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和興奮性氨基酸毒性，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌和血流量，改善微循環(huán)，增強(qiáng)脊髓損傷區(qū)自噬流。具體機(jī)制及相關(guān)因子改變總結(jié)如表1。以上分子機(jī)制不是孤立的，是互相聯(lián)系和影響的，改善微環(huán)境的最終目的是防止神經(jīng)細(xì)胞的死亡和促進(jìn)神經(jīng)元再生、軸突和髓鞘重塑，改善脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能，而微環(huán)境內(nèi)部之間的影響因素又是相關(guān)聯(lián)的。例如在脊髓中度損傷時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體的損傷，自噬體不能通過(guò)溶酶體降解，細(xì)胞內(nèi)自噬體大量堆積，自噬體包裹損傷的線粒體等細(xì)胞器，受損的線粒體釋放大量的活性氧簇(ROS)，ROS促使線粒體膜上生成小孔，膜電位下降，凋亡因子外流，caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。目前,研究脊髓損傷神經(jīng)細(xì)胞死亡方式最多的是細(xì)胞凋亡，但是其它神經(jīng)細(xì)胞死亡方式逐漸被發(fā)現(xiàn)，例如以RIPK1-RIPK3-MLKL壞死復(fù)合物為主的壞死性凋亡Necroptosis、鐵死亡Ferroptosis、炎性小體NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡Pyroptosis等[42]，抑制細(xì)胞凋亡并不能完全改善脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能。有研究認(rèn)為,用抗凋亡泛抑制劑Z-VAD-FMK會(huì)將凋亡的細(xì)胞轉(zhuǎn)向壞死性凋亡[43-44]，以壞死性凋亡的方式死亡，而Z-VAD-FMK結(jié)合壞死性凋亡抑制劑NEC-1可同時(shí)抑制兩種細(xì)胞死亡[45]，電針治療脊髓損傷分子機(jī)制是多靶點(diǎn)的，在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)是否還抑制壞死性凋亡等其它細(xì)胞死亡方式，是在電針治療SCI分子生物學(xué)領(lǐng)域中繼續(xù)研究的方向。