焦艷

[摘要] 目的 分析P37、P16、PAX-2在子宮內(nèi)膜增生癥中的表達(dá)及其意義。 方法 收集2012年12月～2017年8月河北省秦皇島市婦幼保健院接受病理活檢，并經(jīng)病理組織學(xué)活檢確診為子宮內(nèi)膜增生患者的病理組織標(biāo)本，其中單純型及復(fù)雜型子宮內(nèi)膜增生標(biāo)本31個(gè)、不典型子宮內(nèi)膜增生組織標(biāo)本30個(gè);另選取30個(gè)正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本作為對(duì)照。采用免疫組化SP法檢測(cè)不同組織標(biāo)本中P37、P16及PAX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。 結(jié)果 正常子宮內(nèi)膜組織中未見P37蛋白陽(yáng)性表達(dá)，不典型增生癥組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于單純型或復(fù)雜型增生癥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;不典型增生組織中P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)<單純型或復(fù)雜型增生<正常子宮內(nèi)膜組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;不典型增生組織中PAX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)<單純型或復(fù)雜型增生<正常子宮內(nèi)膜組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 P37、P16、PAX-2在不典型子宮內(nèi)膜增生中均有一定異常表達(dá)，值得進(jìn)一步深入探究。

[關(guān)鍵詞] P37;P16蛋白;PAX-2;子宮內(nèi)膜增生癥

[中圖分類號(hào)] R711.74? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（b）-0084-04

[Abstract] Objective To analyze the expression and significance of P37， P16 and PAX-2 in endometrial hyperplasia. Methods From December 2012 to August 2017， in Qinhuangdao Maternal and Child Health Hospital， the pathological tissue specimens of patients with endometrial hyperplasia diagnosed by pathological biopsy were selected， including 31 specimens of simple and complicated endometrial hyperplasia and 30 specimens of atypical endometrial hyperplasia; 30 normal endometrium specimens were selected as controls. The positive expression rates of P37， P16 and PAX-2 protein in different tissue specimens were detected by immunohistochemical SP method. Results There was no positive expression of P37 protein in normal endometrium tissues， the positive expression rate in atypical hyperplasia was higher than simple or complex hyperplasia， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression of P16 protein showed atypical dysplasia tissue < simple or complex hyperplasia < normal endometrium tissue， the difference was statistically significant （P < 0.01）， while the positive expression of PAX-2 protein showed atypical dysplasia < simple or complex hyperplasia < normal endometrium tissue， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion There exists abnormal expression of P37， P16 and PAX-2 in atypical endometrial hyperplasia， which is worthy of further study.

[Key words] P37; P16 protein; PAX-2; Endometrial hyperplasia

子宮內(nèi)膜增生的發(fā)生系因長(zhǎng)期無(wú)孕激素拮抗的雌激素作用所致，是非生理性、非侵襲性的內(nèi)膜增生現(xiàn)象，因腺體大小、形態(tài)、腺體與間質(zhì)比例的改變而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜量表達(dá)增加[1-2];而依據(jù)其增生程度不同，又分為增生內(nèi)膜、簡(jiǎn)單增生、復(fù)雜增生、不典型增生四個(gè)等級(jí)，其中增生內(nèi)膜、簡(jiǎn)單及復(fù)雜型內(nèi)膜增生皆為不伴不典型的子宮內(nèi)膜增生，預(yù)后一般良好;而不典型增生被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌癌前病變，其臨床診治難度大，且預(yù)后相對(duì)較差[3-4]。

P37蛋白是豬鼻支原體的主要免疫原，既往有報(bào)道指出P37蛋白作為原核細(xì)胞微生物，其不僅多種疾病密切相關(guān)，在腫瘤疾病的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中亦發(fā)揮重要價(jià)值[5];P16基因則是由INA4a-ARF位點(diǎn)編碼的MTS-1基因，系抑癌基因的一種，可直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及分裂負(fù)調(diào)控過(guò)程，其基因編碼產(chǎn)物P16蛋白定位于細(xì)胞核蛋白，是細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑2A，對(duì)細(xì)胞分裂周期關(guān)鍵酶CDK4的合成、催化活性均有抑制作用，一旦P16蛋白低表達(dá)、失表達(dá)便可引起細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制，最終產(chǎn)生惡變，形成腫瘤[6]。而PAX-2則是PAX家族成員之一，通常情況下，是腫瘤細(xì)胞生存所必須的條件之一，有研究指出其在子宮內(nèi)膜癌中有異常表達(dá)現(xiàn)象，但關(guān)于其具體表達(dá)卻存異議[7-8]。鑒于此，本研究收集子宮內(nèi)膜增生標(biāo)本，對(duì)P37、P16、PAX-2蛋白在子宮內(nèi)膜增生癥中的表達(dá)及意義進(jìn)行研究，旨在進(jìn)一步補(bǔ)充及完善子宮內(nèi)膜不典型增生的臨床診治，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年12月～2017年8月在河北省秦皇島市婦幼保健院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）接受病理活檢并經(jīng)病理組織學(xué)活檢確診為子宮內(nèi)膜增生患者的病理標(biāo)本，所有患者既往均無(wú)子宮內(nèi)膜增生相關(guān)治療史。其中單純型及復(fù)雜型子宮內(nèi)膜增生標(biāo)本31個(gè)（單純型16個(gè)，復(fù)雜型15個(gè)）、不典型子宮內(nèi)膜增生組織標(biāo)本30個(gè);另選取30個(gè)正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本作為對(duì)照，這些組織標(biāo)本均來(lái)自同期于我院就診的子宮脫垂、子宮頸癌患者的正常子宮內(nèi)膜組織。所有病理組織標(biāo)本固定后均采用梯度酒精（低～高）充分脫水，并用石蠟包埋，按4 μm厚度連續(xù)切片，使組織充分緊貼于硅化載玻片，完成脫水、石蠟包埋、制片后封存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)SP法

SP試劑盒來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：512821CB。取病理組織標(biāo)本置于恒溫箱烘烤，溫度60℃、時(shí)長(zhǎng)30 min，烘烤后再將標(biāo)本置于純二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中浸泡，時(shí)長(zhǎng)30 min，再采用梯度酒精溶液浸泡，浸泡順序由高到底，再用PBS液（0.01 mol/L PBS粉+1000 mL蒸餾水，pH值7.2～7.4）充分洗滌，5 min/次，重復(fù)PBS洗滌3次;3%過(guò)氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，按5 min/次PBS液沖洗3次后抗原修復(fù)，將檸檬鹽酸抗原修復(fù)液置于壓力鍋大火加熱煮沸，再放入組織標(biāo)本后繼續(xù)加熱，直至減壓閥噴氣，噴氣1～2 min后室溫下冷卻，再次按5 min/次PBS液沖洗3次;抗原修復(fù)后分別滴加一抗（鼠抗人P16單克隆抗人來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);抗P37單克隆抗體PD4為本研究組自制，兔抗人PAX-2單克隆抗人來(lái)自cell signaling公司）室溫孵育60 min，按5 min/次PBS液沖洗3次后二抗孵育，室溫下孵育20 min，再次PBS沖洗3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次后DAB（DAB試劑盒來(lái)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)）底物顯色，室溫、暗盒下觀察顯色情況，5～10 min后終止顯色反應(yīng)，再用蘇木精染色2～5 min，蒸餾水沖洗后滴加1%鹽酸酒精分化，再次蒸餾水沖洗5～10 min后氨水返藍(lán)，常規(guī)梯度酒精脫水、純二甲苯透明、中性質(zhì)樹膠封片后鏡檢、拍照。

1.2.2 免疫組化染色結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，單個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，高倍顯微鏡（200倍）下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2.1 P37、P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)? 按染色組織陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞的百分比評(píng)價(jià)陽(yáng)性表達(dá)，依次為陰性（細(xì)胞核、細(xì)胞漿內(nèi)均無(wú)棕色顆粒、或出現(xiàn)與背景相似的棕黃色顆粒）、弱陽(yáng)性（細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，陽(yáng)性百分比為5%～30%）、陽(yáng)性（細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒，比例為>30%～60%）、強(qiáng)陽(yáng)性（細(xì)胞內(nèi)有顏色較深、分布廣泛的棕黃色顆粒，比例>60%），陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性視為陽(yáng)性表達(dá)，其中PAX-2陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色或棕褐色顆粒。

1.2.2.2 PAX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)? 以細(xì)胞胞核或細(xì)胞胞漿內(nèi)可見深黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，其中細(xì)胞核內(nèi)無(wú)著色計(jì)0分、細(xì)胞核內(nèi)見淺黃色顆粒計(jì)1分、細(xì)胞核內(nèi)見棕黃色顆粒計(jì)2分、細(xì)胞胞核內(nèi)見棕褐色顆粒計(jì)3分;染色細(xì)胞比例不足10%計(jì)0分、10%～25%計(jì)1分、>25%～50%計(jì)2分、>50%計(jì)3分，以細(xì)胞核著色強(qiáng)度、染色細(xì)胞比例乘積>3分為PAX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

子宮內(nèi)膜增生癥組織中P37蛋白表達(dá)為棕黃色，位于細(xì)胞漿內(nèi)，而P16蛋白在子宮內(nèi)膜增生癥組織中均大量定位于組織細(xì)胞胞漿內(nèi)，經(jīng)免疫組化染色法可見細(xì)胞漿內(nèi)染色為棕褐色或棕黃色，PAX-2蛋白在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中位于細(xì)胞胞核，以棕褐色著色為陽(yáng)性表達(dá)。

正常子宮內(nèi)膜組織中未見P37蛋白陽(yáng)性表達(dá)，不典型增生癥中陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)43.33%，單純型或復(fù)雜型增生癥組織中偶見陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為9.67%，兩種子宮內(nèi)膜增生癥患者的子宮內(nèi)膜組織中P37蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;正常子宮內(nèi)膜組織中P16蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)，單純型或復(fù)雜型增生組織中陽(yáng)性表達(dá)率為87.09%，P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況：不典型增生組織（70.00%）<單純型或復(fù)雜型增生組織<正常子宮內(nèi)膜組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 =12.262，P < 0.01）;而PAX-2蛋白在不典型增生組織陽(yáng)性表達(dá)為33.33%，單純型或復(fù)雜型增生為67.74%，正常子宮內(nèi)膜組織則高達(dá)96.67%，PAX-2陽(yáng)性表達(dá)情況：不典型增生組織<單純型或復(fù)雜型增組織<正常子宮內(nèi)膜組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 =26.855，P < 0.01）。見圖1～3（封四），表1。

3 討論

子宮內(nèi)膜不典型增生是子宮內(nèi)膜癌癌前病變，子宮切除、子宮切除+雙附件切除等外科手術(shù)方案雖能取得一定治療獲益，但于有生育要求的子宮內(nèi)膜增生患者，外科手術(shù)切除導(dǎo)致其失去生育功能[9]。隨著當(dāng)今對(duì)腫瘤基因、腫瘤分子生物學(xué)的研究日漸深入，多種癌基因、抑癌基因在腫瘤疾病的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲中發(fā)揮的重要作用已引起臨床重視，為腫瘤疾病的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及治療提供了新方向[10]。P37不僅是豬鼻支原體的主要免疫原，也是高親和力運(yùn)輸系統(tǒng)的一部分，可誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子，也可與細(xì)胞骨架蛋白NORPEG產(chǎn)生相互作用力，既往有研究表明[11]，經(jīng)轉(zhuǎn)染P37基因的AGS細(xì)胞形態(tài)顯著變小、變圓，細(xì)胞間黏附能力降低，并最終通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間黏附能力的影響改變細(xì)胞影響、運(yùn)動(dòng)、黏附能力，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、生物個(gè)體發(fā)育有密切關(guān)聯(lián)。本研究顯示，正常子宮內(nèi)膜組織中未見P37蛋白陽(yáng)性表達(dá)，單純型或復(fù)雜型增生癥中偶見陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率僅為9.67%，而不典型增生癥中陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)43.33%;Gomersall等[12]的研究也得出類似結(jié)論，認(rèn)為P37蛋白可激活TLR4受體，誘導(dǎo)癌癥進(jìn)展的基因表達(dá)，其研究還指出P37蛋白或可通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)炎癥因子的調(diào)控影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移。而子宮內(nèi)膜不典型增生作為子宮內(nèi)膜癌癌前病變，P37異常陽(yáng)性表達(dá)或可促進(jìn)疾病進(jìn)展至子宮內(nèi)膜癌。

基于細(xì)胞分子生物學(xué)角度，細(xì)胞惡性腫瘤病變的本質(zhì)系因細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡失控所致;而P16蛋白是抑癌基因的一種，不僅直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，也阻止細(xì)胞周期從G期進(jìn)入S期，從而對(duì)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行負(fù)調(diào)控[13]，本研究顯示，正常子宮內(nèi)膜組織中P16皆呈陽(yáng)性表達(dá)，而在單純型或復(fù)雜型增生、不典型增生組織中呈遞減表達(dá)趨勢(shì)，提示P16蛋白表達(dá)異常，細(xì)胞增殖、分裂負(fù)調(diào)控失控，提示P16蛋白表達(dá)缺失或在疾病惡性病變中發(fā)揮一定作用，這與陸萍等[14]的報(bào)道有類似指出，其研究指出，正常子宮內(nèi)膜組織、不典型增生、子宮內(nèi)膜癌中均有陽(yáng)性表達(dá)，且正常子宮內(nèi)膜組織中P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著高于子宮內(nèi)膜癌;但楊小風(fēng)等[15]卻報(bào)道，在宮頸組織中，P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)卻呈現(xiàn)不同趨勢(shì)，其報(bào)道中子宮上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)中P16蛋白陽(yáng)性表達(dá)僅為12.50%，而子宮上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)及子宮頸癌卻分別高達(dá)84.60%、100.00%、100.00%。

同時(shí)，既往研究中，PAX-2蛋白在泌尿生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，多種腫瘤疾病中均有陽(yáng)性表達(dá)[16]，而本研究中不典型增生組織中PAX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)（33.33%）<單純型或復(fù)雜型增生（67.74%）<正常子宮內(nèi)膜組織（96.67%），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示PAX-2蛋白或可隨病變程度的加重出現(xiàn)缺失加劇現(xiàn)象;張彤等[17]在增生期子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性表達(dá)高達(dá)95.45%，在單純型子宮內(nèi)膜增生、復(fù)雜性子宮內(nèi)膜增生中陽(yáng)性表達(dá)依次為71.42%、70.00%，在非典型性增生中陽(yáng)性表達(dá)卻僅為38.70%，這與本研究所得結(jié)論趨勢(shì)一致，但當(dāng)前關(guān)于PAX-2蛋白在子宮內(nèi)膜增生癥中的功能及其相關(guān)機(jī)制研究仍相對(duì)罕見，還需進(jìn)一步深入探究[18-20]。

綜上所述，P37、P16、PAX-2在不同類型的子宮內(nèi)膜增生癥中表達(dá)均有一定差異，在子宮內(nèi)膜癌癌前病變中存在過(guò)表達(dá)或表達(dá)缺失現(xiàn)象，鑒于當(dāng)前P37、P16蛋白、PAX-2在子宮內(nèi)膜增生癥中的表達(dá)及其意義類報(bào)道相對(duì)少見且研究所得結(jié)論的差異性，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探究。

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（收稿日期：2018-08-13? 本文編輯：蘇? ?暢）