孫音 伍明政 顧洛莎 白潔 顧勁松 于江 閆潤虎 張怡

[摘要] 目的 探討不同配比低溫保護(hù)劑對凍存后人顆粒脂肪裸鼠移植的影響，以優(yōu)化低溫保護(hù)劑的選擇。 方法 取人大腿內(nèi)側(cè)吸脂術(shù)后多余的顆粒脂肪，分別等量存入A、B兩種不同配比的低溫保護(hù)劑中，分別為A組和B組，置于-80℃凍存6個(gè)月。6個(gè)月后將標(biāo)本復(fù)蘇，移植于裸鼠背部皮下，各移植點(diǎn)注射0.2 mL顆粒脂肪。4周后處死裸鼠，取出移植物，進(jìn)行體積、重量檢測，并觀察其蘇木精-伊紅（HE）染色、透射電鏡下的情況。 結(jié)果 A組剩余脂肪平均體積大于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。HE染色示A組新生血管多于B組;透射電鏡下A組脂肪細(xì)胞更加完整，新生脂肪細(xì)胞較多。結(jié)論 A組低溫保護(hù)劑長期凍存的脂肪活性較高，且可用小牛血清取代胎牛血清;脂肪組織深低溫凍存半年以后依然可以進(jìn)行有效移植。

[關(guān)鍵詞] 脂肪顆粒;低溫保護(hù)劑;小牛血清;脂肪細(xì)胞活性

[中圖分類號] R332;R622.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of cryoprotective agents with different proportions on transplantation of frozen human granular fat in nude mice in order to optimize the selection of cryoprotectants. Methods The excess granular fat after liposuction on the inner side of the thigh was taken into the cryoprotective agents of A and B in different proportions， group A and group B respectively and they were stored at -80°C for 6 months. After 6 months， the specimens were resuscitated and transplanted subcutaneously into the back of nude mice， and 0.2 mL granular fat was injected at each transplant site. After 4 weeks， the nude mice were sacrificed， and the grafts were taken out for volume and weight detection， and observed under hematoxylin-eosin （HE） staining and transmission electron microscopy. Results The mean volume of residual fat in group A was greater than that in group B， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. HE staining showed that the neovascularization of group A was more than that of group B. Under transmission electron microscope， the fat cells of group A were more complete and there were more new fat cells. Conclusion The long-term frozen fat of group A cryoprotective agents has higher activity， and fetal bovine serum can be replaced by calf serum. The adipose tissue can still be effectively transplanted after cryopreservation for half a year.

[Key words] Granule fat; Cryoprotective agents; Calf serum; Fat cell activity

脂肪組織凍存一定時(shí)間后仍具有活力并可進(jìn)行臨床移植，這已是不爭的事實(shí)[1-4]。近年來，脂肪凍存及低溫保護(hù)劑也逐漸成為脂肪移植的研究熱點(diǎn)。低溫保護(hù)劑在脂肪冷凍過程中起保護(hù)作用，能不同程度地保持冷凍脂肪組織活力，不同凍存條件下其最適宜的低溫保護(hù)劑不盡相同。二甲基亞砜（DMSO）是常用凍存劑，其具有細(xì)胞毒性，?；旌细咛桥囵B(yǎng)基（DMEM）、胎?；蛐∨Ｑ逡黄鹗褂?。其中，胎?；蛐∨Ｑ遄鳛楸Ｗo(hù)劑，能夠有效地提高脂肪組織凍存及移植后的成活率。胎牛血清價(jià)格十分昂貴，目前的研究趨向于使用小牛血清。然而，關(guān)于小牛血清的最適濃度尚無定論。本研究基于前人經(jīng)驗(yàn)，選取30%、60%小牛血清配制成的凍存液進(jìn)行相關(guān)研究，并比較其凍存后脂肪顆粒再移植的成活率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人脂肪顆粒? 人脂肪顆粒標(biāo)本（由廣美整形美容醫(yī)療門診部提供，患者已簽署知情同意書）來源于行吸脂術(shù)的1名25歲的健康女性，吸脂部位為大腿內(nèi)側(cè)。將純化好的脂肪顆粒分為2份，每份各2.5 mL，分別注入等量的A、B組低溫保護(hù)劑中，將所有凍存管置入4℃冰箱，2 h后移入-20℃冰箱，4 h后移入-80℃深低溫冰箱凍存6個(gè)月后復(fù)溫。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物? 6只7周鼠齡的雌性BALB/c-nu同窩裸鼠（大連醫(yī)科大學(xué)提供），合格證號：NO.21100370 0001087，分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查同意。

1.1.3 儀器與試藥? 儀器：深低溫冰箱（美國賽默飛世爾科技公司）、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、透射電子顯微鏡（JEM-2000EX，日本電子株式會社）、冰凍切片機(jī)（美國賽默飛世爾科技公司）。

試藥：二甲基亞砜（美國Amresco公司）、國產(chǎn)小牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）、高糖培養(yǎng)基（海克隆生物化學(xué)制品北京有限公司）、A組低溫保護(hù)劑（配比為60%小牛血清、15%DMSO、25%DMEM）、B組低溫保護(hù)劑（配比為30%小牛血清、15%DMSO、55%DMEM）。

1.2 方法

1.2.1 移植準(zhǔn)備? ①將標(biāo)本置于37℃水浴箱解凍，吸除溶解后的低溫保護(hù)劑，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3次，加入DMEM待用。用1 mL注射器各抽取6組標(biāo)本0.2 mL顆粒脂肪備用（填充注脂針頭內(nèi)的死腔后，每支注射器內(nèi)的脂肪顆粒為0.2 mL）。②依據(jù)低溫保護(hù)劑配比將大腿內(nèi)側(cè)脂肪顆粒標(biāo)本分為A、B兩組。6只裸鼠隨機(jī)編號為1～6，于每只裸鼠背部左上、左下處標(biāo)記移植區(qū)域及進(jìn)針點(diǎn)，左上為A組，左下為B組。每個(gè)點(diǎn)位移植0.2 mL的脂肪量，將詳細(xì)移植信息記錄于每只裸鼠的信息卡片。③鹽酸氯胺酮腹腔麻醉（100 mg/kg），依據(jù)體重計(jì)算所需麻醉藥劑量，抽取后備用。

1.2.2 移植建模? 裸鼠麻醉后標(biāo)記移植部位，距移植部位下方1 cm左右消毒進(jìn)針點(diǎn)附近皮膚，無菌針頭刺破進(jìn)針點(diǎn)，將備好的0.2 mL脂肪顆粒移植于裸鼠背部皮下。每個(gè)移植點(diǎn)間的間隔約2 cm，拍照、記錄。

1.2.3 飼養(yǎng)觀察? 6只裸鼠飲食、生存條件一致。行移植術(shù)后前3 d，觀察裸鼠有無死亡、移植物有無明顯變化、移植處皮膚有無紅腫，稱重。其后，每周觀察并記錄一次裸鼠的上述基本情況、稱重。

1.2.4 移植物取出與觀察? 4周后，于無菌條件下采用二氧化碳吸入處死裸鼠。沿裸鼠背部正中線縱向切開皮膚并進(jìn)行分離，將移植物留于裸鼠背部（勿將移植物包膜劃破，以免影響觀察），觀察其顏色、大小、表面毛細(xì)血管形成情況等，做好記錄并拍照。見圖1。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)方法? ①微量天平稱量移植物濕重、量水法測量體積，然后將每個(gè)移植物分為兩份，取小米粒大小置于2.5%戊二醛（透射電鏡用）備用，其余部分置于多聚甲醛（冰凍切片用）備用。平均體積減小率=（初始體積-取出移植物體積）/初始體積×100%，初始體積0.2 mL。②冰凍切片蘇木精-伊紅（HE）染色：脂肪顆粒置于多聚甲醛固定20 min后，轉(zhuǎn)移至梯度蔗糖溶液脫水。OCT包埋后快速冷凍，冰凍切片機(jī)調(diào)至適溫后修片，于-80℃冰箱保存。取冰凍切片，烤片后用PBS洗去包埋劑。HE染色后，梯度酒精脫水，二甲苯固定。中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。③透射電鏡觀察：2.5%戊二醛固定液預(yù)固定2 h后PBS沖洗3次，四氧化二鋨染色2 d，PBS沖洗2次后，梯度酒精脫水，移入環(huán)氧丙烷。經(jīng)包埋、超薄切片后，單孔銅環(huán)收集切片，透射電子顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠及移植物生長情況

6只裸鼠移植后生長健康，注射部位無紅腫、感染、破潰及壞死，注射點(diǎn)愈合良好，移植物全部成活。4周時(shí)間內(nèi)，裸鼠體重隨時(shí)間稍有增長。

裸鼠皮膚剝離后，移植物呈淡黃色，與正常脂肪組織顏色相近，質(zhì)地柔軟，表面有一層透亮、較薄的包膜，可見較細(xì)的血管生成。見圖2（封三）。A、B兩組移植物中，A組體積稍大于B組（圖3）。

A組脂肪存活量高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;A組平均體積減小率低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 透射電鏡觀察

電鏡下可見成熟的脂肪細(xì)胞內(nèi)被1個(gè)巨型脂滴所充滿（圖4A），細(xì)胞核呈扁圓形，被巨型脂滴擠于一側(cè);細(xì)胞邊緣有少量體積較小的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體;細(xì)胞膜相對清晰明顯。未成熟的脂肪細(xì)胞含較多分散的小脂滴（圖4B）;細(xì)胞核呈橢圓形，著色較深，形態(tài)較飽滿，位置較居中;較難分辨明顯的細(xì)胞膜輪廓。脂肪細(xì)胞間有血管生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞清晰可見，血管內(nèi)有雙凹圓盤狀成熟紅細(xì)胞，新生血管附近的組織間隙內(nèi)有較多成纖維細(xì)胞（圖4C～D）。A組成熟脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜較B組完整、致密;A組新生脂肪細(xì)胞多于B組，且觀測到的新生血管多于B組。

2.3 HE染色觀察

A組低溫保護(hù)劑的標(biāo)本可見新生脂肪細(xì)胞形態(tài)良好，排列均一，有明顯小血管形成，血管數(shù)量較多、分布相對均勻，偶有空泡樣缺損，未見明顯囊腔及壞死。B組新生脂肪細(xì)胞大小均一，血管數(shù)目較A組略少，脂肪細(xì)胞排列緊密，體積較小，空泡樣缺損較多，脂肪細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜不及A組清晰（圖5）。因選取了移植物部分組織做透射電鏡，HE染色組織切片不完整，切片方向也很難控制在橫斷面較多的角度，故未進(jìn)行血管數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。

3 討論

脂肪顆粒凍存中可用小牛血清取代胎牛血清;凍存后移植，以60%小牛血清、15%DMSO、25%DMEM為低溫保護(hù)劑的凍存效果較好;脂肪組織深低溫凍存半年以后依然可以進(jìn)行有效移植。

大量研究證實(shí)[5-6]，新鮮采集的自體脂肪組織由于離體時(shí)間短暫，各種生物活性均接近正常狀態(tài)，移植存活率必定高于冷凍儲存者。因此，本研究未采用新鮮脂肪作為參照。低溫儲存脂肪，-80℃和-196℃的凍存溫度和滿意度基本得到業(yè)界的一致認(rèn)可，但目前多數(shù)研究[7-9]的儲存時(shí)間為數(shù)周至數(shù)月。目前，關(guān)于凍存劑各成分的比例的研究也少。綜合考慮，本研究選擇基本條件一致、-80℃下儲存于A、B兩種低溫保護(hù)劑凍存半年后的人大腿內(nèi)側(cè)脂肪顆粒移植于免疫缺陷的裸鼠背部，根據(jù)移植物剩余體積、新生血管的生成量及脂肪細(xì)胞形態(tài)來判斷其生物活性及移植效果。