張家寧 曹夢遠 李林成 劉銘傳 劉洋 何亭

[摘要] 目的 探討褪黑素（MT）對內毒素（LPS）誘導的膿毒癥腎損傷小鼠炎癥及腎臟細胞凋亡的影響，以及MT對膿毒癥腎損傷的作用及其與microRNA-146a（miR-146a）的關系。 方法 將48只雄性Balb/c小鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術組（Sham組）、MT治療組（MT組）以及假治療組（NS組），每組16只。MT組、NS組小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg體重）制備膿毒癥模型，MT組小鼠于建模前半小時、建模時、傷后4 h分3次注射MT（30 mg/kg體重），NS組及Sham組小鼠在MT組相應給藥時間點注射等量生理鹽水。LPS處理24 h后，檢測各組白細胞介素（IL）-1β、IL-6 mRNA的水平、miR-146a的水平、凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達情況，以及血清肌酐（Cr）及尿素氮（BUN）水平。LPS處理72 h后觀察各組小鼠腎臟病理變化及損傷情況。 結果 ①Sham組腎小球、腎小管結構完整，NS組腎小管內管型形成，腎小管結構不清，腎小球固縮，大量炎癥細胞浸潤;MT組壞死腎小球數(shù)目明顯少于NS組。②NS組、MT組血清Cr、BUN含量顯著高于Sham組（P < 0.01），MT組血清Cr、BUN含量則顯著低于NS組（P < 0.01）。③MT組腎臟組織Cleaved-caspase-3、Bax表達量顯著低于NS組（P < 0.01）。④三組腎臟組織中IL-1β和IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中MT組腎臟組織IL-1β、IL-6顯著低于NS組（P < 0.01）。⑤三組腎臟組織中miR-146a水平比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），MT組顯著高于NS組（P < 0.01）。 結論 MT對LPS誘導的膿毒癥小鼠腎損傷有明顯治療作用，這種治療作用可能是通過上調miR-146a，進而抑制炎癥及細胞凋亡實現(xiàn)的。

[關鍵詞] 褪黑素;膿毒癥;腎損傷;微小RNA-146a

[中圖分類號] R631? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of melatonin （MT） on apoptosis of renal cells and inflammation in lipopolysaccharide （LPS）-induced septic mice， and to explore the effect of MT on renal injury in sepsis as well as the role that microRNA-146a（miR-146a） plays. Methods Forty-eight male Balb/c mice were divided into sham-operated group （Sham group）， MT treatment group （MT group） and placebo group （NS group） according to random number table method， with 16 mice in each group. Mice in the latter two groups were injected with LPS （10 mg/kg body weight） intraperitoneally to prepare sepsis model. Mice in MT group were injected with MT （30 mg/kg body weight） three times separately at half an hour before LPS injection， the same time as LPS injection and 4 hours after injection. At the same time，mice in NS group and Sham group were injected with same volume saline. After LPS treatment for 24 hours， the levels of interleukin （IL）-1β and IL-6 mRNA， miR-146a， the expression of apoptotic proteins Caspase-3 and Bax， serum creatinine （Cr） and urea nitrogen （BUN） were detected. After LPS treatment for 72 hours， the renal pathological changes and injuries of mice in each group were observed. Results ①The renal structure was normal in Sham group. The renal tubules in NS group were of tubular type， with unclear tubular structure， glomerular pyknosis， and a large number of inflammatory cells infiltrating; the number of necrotic glomeruli in MT group was much less than that in NS group. ②The levels of serum Cr and BUN in NS group were significantly higher than those in Sham group （P < 0.01）. The levels of Cr and BUN in MT group mice were significantly lower than those in NS group （P < 0.01）. ③The levels of Cleaved-caspase 3 and Bax in MT group mice were significantly lower than those in NS group （P < 0.01）. ④The levels of IL-1β and IL-6 in these three groups mice had statistically significant difference （P < 0.05）. In MT group， the levels of IL-1β and IL-6 in renal tissues were lower than those in NS group （P < 0.01）. ⑤The levels of miR-146a in renal tissues were highly statistically different in these three groups mice （P < 0.01）. In MT group， it was significantly higher than that in NS group （P < 0.01）. Conclusion MT can significantly improve renal injury in LPS-induced septic mice， which may related to the upregulation of miR-146a and suppression of inflammation and cell apoptosis.

[Key words] Melatonin; Sepsis; Renal injury; microRNA-146a

膿毒癥是指感染或嚴重創(chuàng)傷導致的不可控的炎性反應，其發(fā)病率和死亡率極高，是重癥監(jiān)護室中患者死亡的主要原因之一[1]。膿毒癥常致多器官功能衰竭綜合征（MODS），腎臟是其經常累及的臟器之一[2]。據報道，膿毒癥患者中急性腎損傷發(fā)生率高達40%，嚴重威脅患者生命健康安全[3]。褪黑素（MT）是由松果體分泌的吲哚類神經內分泌激素，具有調節(jié)生物鐘、抗氧化、清除氧自由基、抗炎、調節(jié)免疫等多種生物學功能[5-6]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)MT對膿毒癥大鼠有一定的保護作用[7]。膿毒癥合并急性腎損傷病死率較高，是亟待解決的醫(yī)學難題。本研究擬通過觀察MT對膿毒癥小鼠急性腎損傷及miR-146a水平的影響，初步闡明MT對膿毒癥腎損傷的作用及其與miR-146a水平的關系，為疾病的治療提供新思路，為相關研究提供新視角。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑與儀器

健康清潔級雄性Balb/c小鼠48只，重量20～25 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（軍）2012-0022。Cleaved-caspase-3（貨號：9661）、Bax（貨號：14796S）多克隆抗體、小鼠抗β肌動蛋白抗體（貨號：3700）購自美國CST公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：01334）、山羊抗鼠IgG二抗（批號：01325）均購自武漢博士德生物工程有限公司;內毒素（LPS）（批號：037M4015V）購自Sigma公司;Trizol（批號：AHF1813A）試劑購自美國Invitrogen公司;肌酐（Cr）（貨號：C011-2）、尿素氮（BUN）（貨號：C013-2）ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;SYBR Green MasterMix（批號：A8605）購自美國ABI公司。3-18K型高速冷凍離心機購自Sigma公司;紫外線分光度計、mini PROTEAN型垂直電泳儀、電轉移儀均購自美國Bio-Rad公司;7900HT型熒光定量PCR儀購自美國應用生物公司;ImageMaster凝膠成像分析儀購自Applied Biosystems公司。

1.2 模型制備及分組處理

Balb/c小鼠采取22～26℃ SPF環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食，光照控制12 h明/12 h暗，濕度50%～60%。實驗前分籠飼養(yǎng)24 h，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組（Sham組）、MT治療組（MT組）與假治療組（NS組），每組16只。MT組與NS組小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg體重），MT組小鼠于建模前半小時、建模時、傷后4 h分3次注射MT（30 mg/kg體重），NS組小鼠在MT組相應給藥時間點注射等量生理鹽水;Sham組僅在相應給藥時間點腹腔注射等量生理鹽水。各組小鼠處理后分籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3 標本采集

LPS注射24 h后，各組半數(shù)小鼠采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，眼球取血，室溫靜置15 min后，1500 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，收集血清分裝，-80℃凍存。采血后脫頸處死小鼠。各組其余半數(shù)小鼠，在LPS注射72 h后，麻醉后頸椎脫臼處死，迅速切取雙側腎臟，部分組織用體積分數(shù)10%的甲醛固定，部分組織-80℃凍存。

1.4 觀察指標

1.4.1 腎臟組織形態(tài)? 取各組甲醛固定的腎臟組織標本，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚切片，脫蠟后HE染色，智能生物圖像導航儀400倍鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4.2 血清Cr、BUN含量? 將收集到的血清稀釋10倍后測定腎功能生化指標Cr和BUN的含量，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 腎臟組織中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達? 采用蛋白質印跡法（Westen blot）進行檢測。將各組每只小鼠凍存腎臟組織標本50 mg加組織細胞裂解液勻漿，提取蛋白，BCA定量。蛋白樣本均以50 μg上樣，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕法轉膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔抗鼠Cleaved-caspase-3、Bax一抗（稀釋比例均為1∶1000），4℃孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶3000），37℃孵育1 h?；瘜W發(fā)光、顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)行灰度掃描分析，系統(tǒng)自帶軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

1.4.4 腎臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達? 取各組每只小鼠凍存腎臟組織標本50 mg，用Trizol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，反轉錄合成互補DNA。引物由日本TaKaRa公司設計合成，序列及產物大小見表1。按照SYRB Green熒光定量試劑盒說明書進行PCR，以GAPDH為內參照，PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火與延伸20 s，共40個循環(huán)。采用△循環(huán)閾值（Ct）法處理結果并計算腎臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA相對表達量，即2-△△Ct。實驗重復3次。

1.4.5 腎臟組織中miRNA-146的表達? 采用實時熒光定量RT-PCR法檢測。取各組每只小鼠凍存腎臟組織標本50 mg，用Trizol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，反轉錄合成互補DNA。引物由日本TaKaRa公司設計合成，序列分別為miR-146a：5′-TGAGAACTGAATTCCATAGGC-3′;U6：5′-GTGCTCGCTTCGGC-AGCACATAT-3′。按照SYRB Green熒光定量試劑盒說明書進行PCR，以U6為內參照，PCR反應條件不變。采用△循環(huán)閾值（Ct）法處理結果計算腎臟組織中miR-146a相對表達量，即2-△△Ct。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，三組間比較采用One-way ANOVA檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠腎臟組織形態(tài)比較

傷后24 h，Sham組小鼠腎臟組織與正常腎臟組織無異;NS組腎小球固縮，腎小管上皮變性壞死，腎間質充血嚴重，大量炎癥細胞浸潤;MT組腎臟組織損傷程度遠低于NS組。見圖1。

2.2 三組小鼠血清Cr及BUN水平比較

三組小鼠血清Cr及BUN水平總體比較差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。NS組、MT組明顯高于Sham組（P < 0.01），MT組明顯低于NS組（P < 0.01）。見表2。

2.3 三組小鼠腎臟組織中凋亡相關蛋白表達比較

三組小鼠腎臟組織中Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。MT組、NS組腎臟組織中凋亡相關分子Cleaved-caspase 3、Bax蛋白表達水平明顯高于Sham組（P < 0.01），NS組明顯高于MT組（P < 0.01）。見表3、圖2。

2.4 三組小鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6的mRNA表達水平比較

三組小鼠腎臟組織中IL-1β、IL-6的mRNA水平總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。MT組、NS組IL-1β、IL-6的mRNA表達水平明顯高于Sham組（P < 0.01），MT組明顯低于NS組（P < 0.01）。見表4。

2.5 三組小鼠腎臟組織中miR-146a的表達水平比較

Sham組、MT組及NS組小鼠腎臟組織miR-146a的表達水平分別為（1.00±0.03）、（3.44±0.95）、（2.12±0.61），總體比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。MT組及NS組均高于Sham組（P < 0.01），MT組顯著高于NS組（P < 0.01）。

3 討論

膿毒癥是ICU患者死亡的重要原因，而腎臟則是膿毒癥最常累及的臟器之一[2]。膿毒癥伴急性腎損傷發(fā)病率高，且病死率明顯高于未合并急性腎損傷的膿毒癥患者，亦高于非膿毒癥急性腎損傷患者[8]。因此，在膿毒癥患者的治療過程中腎損傷的治療十分重要。膿毒癥發(fā)病機制十分復雜，目前研究認為膿毒癥的發(fā)病與宿主炎性反應平衡失調和免疫功能紊亂密切相關[9]。而膿毒癥導致的腎血流動力學的改變和大量炎性因子在腎臟的聚集是膿毒癥伴發(fā)急性腎損傷的主要致病因素[10]。研究表明，MT具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、調節(jié)免疫及改善微循環(huán)等多種生物學作用[5-6]，這對炎性疾病的治療有重要意義。

本研究通過對比分析不同分組小鼠的腎臟病理改變情況，發(fā)現(xiàn)MT組小鼠腎臟組織炎癥細胞浸潤水平和腎臟組織損害程度要明顯低于未經治療的小鼠。同樣，MT組的小鼠血清中Cr、BUN含量也明顯低于未治療小鼠，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義。這提示MT對膿毒癥伴發(fā)的急性腎損傷起到了一定的治療作用。Caspase-3與Bax蛋白在介導細胞凋亡的信號通路中發(fā)揮著重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，NS組活化的Caspase-3及Bax水平明顯高于Sham組，提示LPS誘導產生了顯著的腎損傷;而經過MT治療后，活化的Caspase-3及Bax水平有了顯著的下降，提示MT治療對抑制腎臟細胞凋亡具有一定的意義。IL-1β、IL-6作為重要的促炎及免疫調控因子，在膿毒癥發(fā)展過程中具有重要的作用[9]。經MT治療的小鼠體內IL-1β、IL-6水平明顯降低，提示MT可顯著降低小鼠體內的炎性因子水平，減輕過度活化的炎性反應對組織的損傷，從而起到改善膿毒癥的作用。

microRNA是一種廣泛存在于真核細胞中，在體液中穩(wěn)定存在，幾乎不受RNA酶、溫度等因素影響的物質[12]，在細胞分化、增殖凋亡中起到重要作用[13]。此外，微小RNA作為一種血清學標志物，其在惡性腫瘤、組織損傷等方面的診斷價值也得到了諸多學者的認同[14-15]，并對膿毒癥早期診斷及其嚴重程度、預后的判斷具有重要的意義[16-17]。miR-146a是miR-146家族中的一員，研究表明，miR-146a為核因子κB（NF-κB）依賴性基因，通過對其作用靶點腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF-6）與白細胞介素1受體相關激酶1（IRAK-1）進行調控，進而起到降低TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子的作用，抑制炎性因子的表達和炎性細胞的浸潤[18-20]。在膿毒癥誘導的急性肺損傷中，研究者發(fā)現(xiàn)提高miR-146a的水平，可有效抑制膿毒癥引起的炎癥反應[21]，且有研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在固有免疫中發(fā)揮負反饋調控作用[22]。因此，提高miR-146a的水平成為許多炎性疾病潛在的治療策略。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NS組小鼠體內miR-146a的水平高于Sham組，這可能與促炎因子刺激使miR-146a表達升高有關[23]。MT組中miR-146a顯著升高，且膿毒癥癥狀顯著減輕，結合既往研究，提示MT組腎損傷情況的好轉可能與miR-146a水平的升高密切相關。

綜上，本研究認為，MT可提高動物體內miR-146a的水平，進而拮抗炎性因子的表達，減少組織細胞凋亡，抑制炎性反應，減輕膿毒癥導致的急性腎損傷，進而改善膿毒癥結局。

[參考文獻]

[1]? van Zanten AR，Brinkman S，Arbous MS，et al. Guideline Bundles Adherence and Mortality inSevere Sepsis and Septic Shock [J]. Crit Care Med，2014，42（8）：1890-1898.

[2]? Singer M，Deutschman CS，Seymour CW，et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock（Sepsis-3） [J]. JAMA，2016，315（8）：801-810.

[3]? Bagshaw SM，George C，Bellomo R，et al. Early acute kidney injury and sepsis：a multicentre evaluation [J]. Crit Care，2008，12（2）：R47.

[4]? Nahid MA，Pauley KM，Satoh M，et al. miR-146a is critical for endotoxin-induced tolerance. Implication on innate immunity [J]. J Biol Chem，2009，284（50）：34590-34599.

[5]? Tocharus J，Chongthammakun S，Govitrapong P. Melatonin inhibits amphetamine-induced nitric oxide synthase mRNA overexpression in microglial cell lines [J]. Neurosci Lett，2008，439（2）：134-137.

[6]? Maestroni GJ. The immunotherapeutic potential of melatonin [J]. Expert Opin Investiq Drugs，2001，10（3）：467-476.

[7]? 宋潔瓊，吳威，陳嵩，等.褪黑素對脂多糖誘導的膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用[J].中國臨床醫(yī)學，2016，23（5）：550-553.

[8]? Nisula S，Kaukonen KM，Vaara ST，et al. Incidence，risk factors and 90-day mortality of patients with acute kidney injury in Finnish intensive care units：the FINNAKI study [J]. Intensive Care Med，2013，39（3）：420-428.

[9]? 姚詠明，張艷敏.膿毒癥發(fā)病機制最新認識[J].醫(yī)學研究生學報，2017，30（7）：678-683.

[10]? Dellepiane S，Marengo M，Cantaluppi V. Detrimental cross-talk between sepsis and acute kidney injury：new pathogenic mechanisms，early biomarkers and targeted therapies [J]. Crit Care，2016，20：61.

[11]? Valero JG，Cornutthibaut A，Juge R，et al. μ-Calpain conversion of antiapoptotic Bfl-1（BCL2A1）into a prodeath factor reveals two distinct alpha-helices inducing mitochondria-mediated apoptosis [J]. PLoS One，2012，7（6）;e38620.

[12]? Chen X，Ba Y，Ma L，et al. Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases [J]. Cell Res，2008，18（10）：997-1006.

[13]? Bartel DP. MicroRNAs：target recognition and regulatory functions [J]. Cell，2009，136（2）：215-233.

[14]? Wittmann J，Jack H. Serum microRNAs as powerful cancer biomarkers [J]. Biochimica Biophys Acta，2010，1806（2）：200-207.

[15]? Laterza OF，Lim L，Garrettengele PW，et al. Plasma MicroRNAs as sensitive and specific biomarkers of tissue injury [J]. Cli Chem，2009，55（11）：1977-1983.

[16]? Wang H，Zhang P，Chen W，et al. Serum microRNA signatures identified by Solexa sequencing predict sepsis patients′ mortality：a prospective observational study [J]. PloS One，2012，7（6）：e38885.

[17]? Wang HJ，Zhang PJ，Chen WJ，et al. Four serum microRNAs identified as diagnostic biomarkers of sepsis [J]. J Trauma Acute Care Surg，2012，73（4）：850-854.

[18]? Jiang W，Kong L，Ni Q，et al. miR-146a Ameliorates Liver Ischemia/Reperfusion Injury by Suppressing IRAK1 and TRAF6 [J]. PLoS One，2014，9（7）：e101530.

[19]? Selvamani SP，Mishra R，Singh SK. Chikungunya Virus Exploits miR-146a to Regulate NF-κB Pathway in Human Synovial Fibroblasts [J]. PLoS One，2014，9（8）：e103624.

[20]? 林海煥，莫澤珣，蘇和毅，等.循環(huán)微小RNA作為膿毒癥生物標志物的研究進展[J].中華危重病急救醫(yī)學，2016， 28（8）：752-755.

[21]? 孟建斌，孫麗萍，瓦永祿，等.miRNA-146a在膿毒癥引起的急性肺損傷中的作用機制[J].解放軍醫(yī)學雜志，2017， 42（3）：207-210.

[22]? Li C，F(xiàn)u W，Zhang Y，et al. Meta-Analysis of microRNA-146a rs2910164 G>C polymorphism association with autoimmune diseases susceptibility，an update based on 24 studies [J]. PLoS One，2015，10（4）：e121918.

[23]? Perry MM，Moschos SA，Williams AE，et al. Rapid Changes in MicroRNA-146a Expression Negatively Regulate the IL-1β-Induced Inflammatory Response in Human Lung Alveolar Epithelial Cells [J]. J Immunol，2008，180（8）：5689-5698.

（收稿日期：2018-06-08? 本文編輯：羅喬荔）