張 怡，周曉紅，靳曉飛，董賢慧，于文濤，張 穎，成 媛，高維娟

(河北中醫(yī)學院，河北省中醫(yī)藥防治心腦血管病基礎研究重點實驗室， 石家莊 050091)

中風(stroke)具有高發(fā)病率及高致死致殘率的特點，是造成我國居民死亡的首位原因。中風分為出血性中風和缺血性中風，其中大多數(shù)患者屬于缺血性中風(87%)[1]。大量研究證實梗死組織周邊缺血半暗帶血流的恢復再通是減輕腦缺血臨床癥狀的最有效的治療策略，然而，伴隨而來的腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)的發(fā)生有時卻會造成更為嚴重的腦損傷[2]。腦組織中心缺血區(qū)內神經(jīng)元以壞死為主，而缺血半暗帶內可逆性的細胞凋亡是主要的細胞死亡機制，與最終的梗死面積密切相關[3]。中藥黃芪是傳統(tǒng)的益氣活血藥，在治療中風方面具有數(shù)千年的歷史[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：黃芪注射液可有效減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，抑制神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[5]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，其是否能通過抑制細胞凋亡減輕缺氧缺糖/復氧復糖(oxygen and glucose deprivation/ reoxygenation, OGD/R)HT22細胞損傷有待進一步探究。因此，本研究以常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的HT22細胞為對象，通過OGD/R模擬腦缺血再灌注損傷過程，探討黃芪甲苷在OGD/R損傷中的神經(jīng)保護作用及具體作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

HT22細胞(小鼠海馬神經(jīng)元細胞系)，由河北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗中心許順江教授惠贈。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購于美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自BIOND公司；Triton X-100、多聚賴氨酸均購自北京索萊寶科技有限公司，Bcl-2單克隆抗體購自Abcam公司；Bax多克隆抗體、Alexa Fluor488標記的山羊抗小鼠IgG、Cy3標記驢抗兔IgG、DAPI染液均購自武漢谷歌生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI 雙染色試劑盒購于BD公司；黃芪甲苷(純度>98%)購于上海源葉生物科技有限公司。

超凈工作臺SW-CJ-ID型購于蘇州凈化公司；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱3111型、三氣培養(yǎng)箱3131型及多功能微孔板讀數(shù)儀Varioskan LUX型購于Thermo公司；倒置顯微鏡DMI3000B型、熒光顯微鏡DM5000B型購于Leica公司；流式細胞儀FC 500 MCL 型購于Beckman公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HT22細胞培養(yǎng)

HT22細胞采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖細胞培養(yǎng)液并置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2，飽和濕度)中進行培養(yǎng)，細胞復蘇后培養(yǎng)1～2代后進行OGD/R模型建立。

1.3.2 HT22細胞缺氧缺糖/復氧復糖模型的建立及實驗分組

將HT22細胞隨機分為4組：正常對照組(Control)、缺氧缺糖/復氧復糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)組(Model)、黃芪甲苷組(AS-IV)和溶劑對照組(DMSO)。除正常對照組外，其余各組細胞均氧糖剝奪6 h后進行復氧復糖，建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型：棄去HT22細胞正常細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)液)，PBS洗2次后加入DMEM無糖培養(yǎng)基，然后放入含94% N2+5% CO2+1% O2的37℃三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，將DMEM無糖培養(yǎng)基更換為正常細胞培養(yǎng)液，放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。AS-IV組于復氧復糖的同時給予黃芪甲苷處理(終濃度為100 μmol/L)，24 h后觀察細胞形態(tài)并進行指標檢測。

1.3.3 CCK-8測細胞活性

各組細胞于OGD/R 24 h 后分別于96孔板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min后在多功能微孔板讀數(shù)儀中測OD 450 nm值，檢測細胞活性。

圖1 光學顯微鏡下各組細胞形態(tài)學觀察(×200)Figure 1 Morphological observation of the cell morphology in each group under an optical microscope

1.3.4 LDH漏出率檢測

在96孔板中加入細胞上清液及LDH試劑，混勻，室溫靜置5 min后在多功能微孔板讀數(shù)儀中測OD 450 nm值，此為細胞上清中LDH釋放量。向原含細胞的培養(yǎng)板中加入1% Tritonx-100，室溫反應20 min后取細胞反應液及LDH試劑混勻，室溫靜置5 min，450 nm測定吸光值為細胞破膜液LDH釋放量。LDH漏出率(%)=上清LDH /(上清LDH+細胞破膜液LDH)×100%。

1.3.5 Bax、Bcl-2免疫熒光檢測

將細胞爬片用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)固定20 min；含1%Triton X-100的PBS液破膜15 min；BSA室溫孵育30 min；甩掉封閉液后先后滴加配好的Bax多克隆抗體(1∶100)和Bcl-2單克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜；PBS洗去一抗后滴加Alexa Fluor488標記的山羊抗小鼠IgG(1∶300)和Cy3標記驢抗兔IgG(1∶100)，避光室溫孵育50 min；PBS洗去二抗后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min；封片；每張細胞爬片隨機選取3個視野進行拍照。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

吸出并收集細胞上清液，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞后用預冷的PBS清洗兩遍，加入100 μL 1×binding buffer 重懸細胞后再分別加入FITC和PI染液各5 μL，室溫避光反應15 min，加入400 μL 1×binding buffer，上機檢測細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察缺氧缺糖/復氧復糖 HT22細胞的形態(tài)變化

Control組細胞表現(xiàn)為貼壁生長，細胞呈兩極或多極，突起明顯，突起之間相互交織成網(wǎng)狀，胞體折光性強；與Control組相比，Model組和DMSO組細胞胞體突觸明顯減少，細胞皺縮、變圓，胞質凝聚，細胞間連接大量減少，細胞貼壁不緊，部分細胞團脫落，胞體折光性下降；與Control組比較，AS-IV組上述表現(xiàn)有所緩解。見圖 1。

2.2 CCK-8檢測缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞活性

與Control組相比，Model組、DMSO組及AS- IV組細胞活性均顯著下降(P<0.05)；與Model組比較，AS- IV組細胞活性顯著升高(P<0.05)，DMSO組細胞活性無差別。見 圖2。

2.3 缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞LDH漏出率

與Control組相比，Model組、DMSO組及AS- IV組LDH漏出率均顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，AS- IV組LDH漏出率顯著降低(P<0.05)，DMSO組細胞LDH漏出率無差別。見圖3。

注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。圖2 缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞活性檢測Note. Compared with the Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with the Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 2 Viability of the HT22 cells treated by OGD/R was determined by CCK-8 assay

注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。圖3 缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞LDH漏出率Note. Compared with the Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with the Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 3 LDH level (%) of the HT22 cells treated by OGD/R

2.4 免疫熒光檢測缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞Bcl-2、Bax表達

與Control組相比，Model組細胞Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05)，AS-IV組細胞Bax/Bcl-2僅有升高趨勢(P>0.05)；與Model組比較，AS-IV組細胞Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 流式細胞術檢測缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞凋亡率

與Control組相比，Model組及AS-IV組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，AS-IV組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。實驗結果與免疫熒光檢測結果相似。見圖5。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是腦缺血溶栓治療及外科手術治療中的常見并發(fā)癥，指腦組織在缺血情況下恢復血流供應后損傷加重的現(xiàn)象[6]。CIRI發(fā)生機制十分復雜，細胞內Ca2+超載、自由基過量生成、興奮性氨基酸毒性、炎癥級聯(lián)反應、細胞調亡等各種機制先后或重疊發(fā)生[7]，各種因素累積疊加，形成惡性循環(huán)，最終造成腦組織不可逆的損傷。

研究證實細胞凋亡為CIRI繼發(fā)性損傷發(fā)生的重要機制。腦缺血發(fā)生后，缺血中心區(qū)內血流減少并伴隨著不可逆的神經(jīng)細胞壞死，而細胞凋亡則主要存在于缺血半暗帶并對最終腦梗死面積具有決定作用[8]。腦缺血后線粒體外膜通透性增加，細胞色素C(cytochrome C)由線粒體釋放入胞質，從而激活caspase-3級聯(lián)反應，最終導致DNA降解[9]。此過程中，Bcl-2家族成員調控著蛋白的易位和激活[10]，CIRI后由于缺血等刺激使Bax易位至線粒體并增強線粒體膜通透性，導致cytochrome C和AIF的釋放，從而引發(fā)細胞凋亡的發(fā)生，而Bcl-2則通過穩(wěn)定線粒體膜電位和阻止cytochrome C釋放來抑制細胞凋亡，Bcl-2與Bax兩者的比例是決定細胞凋亡發(fā)生與否的重要因素[11-12]。

注：熒光圖片：綠色，Bcl-2；紅色，Bax；藍色，DAPI。注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01。與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。圖4 免疫熒光染色檢測缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞Bax和Bcl-2的比例Note. Fluorescent images: green,Bcl-2；red, Bax；blue, DAPI. Compared with Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 4 Comperison of the Bax/Bcl-2 ratios of the OGD/R treated HT22 cells. Immunofluorescence staining

圖5 流式細胞術檢測缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞凋亡率Figure 5 Changes of the apoptosis rates in HT22 cells examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，味甘，性微溫，具有補氣固表、利尿消腫、托毒生肌之功效，臨床上常用于治療脾胃虛弱、表虛自汗、膿毒潰瘍、半身不遂等癥[13]。黃芪用于治療中風具有數(shù)千年的歷史，更為治療缺血性中風常用方——補陽還五湯中的君藥，目前廣泛應用于臨床腦血管病的治療。黃芪甲苷為黃芪主要活性成分之一，具有清除氧自由基、抑制細胞凋亡、抗炎、抗血小板凝集等生物活性[14]。研究證實黃芪甲苷能有效降低腦缺血再灌注損傷小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率，抑制caspase-3蛋白的表達，對受損腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。

缺氧缺糖/復氧復糖是一種公認的用以模擬腦缺血再灌注損傷研究的體外模型[16]，本研究以HT22細胞為實驗對象，通過缺氧缺糖/復氧復糖模擬腦缺血再灌注損傷過程，采用黃芪甲苷對缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞進行處理，旨在探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制。研究結果證實：缺氧缺糖/復氧復糖導致細胞活力顯著下降，LDH漏出率增加，細胞損傷嚴重；而給予黃芪甲苷處理后，細胞活力顯著升高，LDH漏出率顯著下降，細胞損傷明顯減輕，證實黃芪甲苷對缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞具有保護作用。在此基礎上又進一步探索了黃芪甲苷的作用機制。通過觀察HT22細胞Bax/Bcl-2及凋亡率的變化，探索黃芪甲苷對缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺糖/復氧復糖導致HT22細胞Bax/Bcl-2及凋亡率顯著升高，細胞凋亡嚴重；而給予黃芪甲苷處理后HT22細胞Bax/Bcl-2及凋亡率均顯著下降，說明黃芪甲苷可通過抑制細胞凋亡發(fā)揮對缺氧缺糖/復氧復糖HT22細胞的保護作用?；谏鲜鲅芯?，本課題組擬通過離體和在體實驗兩方面進一步探討黃芪甲苷發(fā)揮凋亡調控作用的具體通路。