劉媚娜，蘇看看，張海月，金艷慧，楊麗紅，李小龍，王明山

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

蛋白C（protein C，PC）是由肝臟合成的一種維生素K依賴性糖蛋白，為機體PC抗凝系統(tǒng)中的中心成分，其本身是無活性的酶原，在體內(nèi)被水解成活化蛋白C（activated protein C，APC）。APC具有抗凝、促纖溶和維持血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)定等功能[1]。PC缺乏可使機體處于高凝狀態(tài)，易導致血栓形成。遺傳性PC缺陷癥通常為常染色體顯性遺傳，與蛋白C基因（PROC）的突變有關(guān)[2]。本研究對1例遺傳性PC缺陷癥家系進行實驗室表型檢測和基因突變分析，發(fā)現(xiàn)了導致該家系致病的PROC基因突變位點，并采用生物信息學軟件對突變位點進行分析，初步探討其分子致病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，女，39歲，5年前患有“下肢深靜脈血栓形成”，之后長期不規(guī)則口服華法林進行抗凝治療。2周前，由于自行停用華法林5 d，后因下肢疼痛而入院。輔助檢查顯示，左腿深靜脈血栓形成，抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）陽性，血漿PC活性（PC∶A）為39%（70%～130%），其他凝血相關(guān)指標均在參考范圍內(nèi)，被診斷為“PC缺乏、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、下肢深靜脈血栓形成和疑似鼻竇血栓形成”。住院后期，頭顱MRI顯示靜脈竇血栓形成和腦梗死，尿激酶溶栓治療后死于顱內(nèi)出血。共調(diào)查先證者及家系其他成員3代6人，肝、腎功能均無異常。先證者的父親在47歲時死于腦靜脈竇血栓形成，哥哥在44歲時因肺靜脈栓塞而死亡。家系遺傳圖譜見圖1。選擇100名健康體檢者建立本次實驗室凝血表型指標正常參考值和用于突變多態(tài)性的篩查。年齡22～56歲，男53名、女47名，無肝、腎功能異常且無其他基礎性疾病。本通過本院倫理委員會審查，實驗前所有受檢者均簽署知情同意書。

圖1 遺傳性PC缺陷癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理：采集受檢者外周靜脈血2.7 mL，以109 mmol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，3 000 r/min離心10 min，上層血漿用于凝血指標檢測，2 h內(nèi)檢測完畢；下層血細胞用于提取基因組DNA，并進行PCR擴增及測序。

1.2.2 血漿表型指標檢測：在Stago STA-R全自動血凝儀（法國Stag公司）上用發(fā)色底物法檢測血漿PC∶A、蛋白S活性（PS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A），免疫比濁法檢測D-二聚體（D-D）。采用ELISA法檢測蛋白C抗原（PC∶Ag）（試劑盒均購自溫州長風公司）。

1.2.3 PROC基因檢測：基因組DNA提取試劑盒提取先證者及家系成員外周血基因組DNA。參照文獻[3]設計合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。在ABI Thermalcycler 2720上PCR擴增PROC基因所有外顯子及側(cè)翼序列。PCR體系為25 μL。PCR反應程序為：①在95 ℃變性5 min；②變性（95 ℃）、退火和延伸（72 ℃）各30 s，共30個循環(huán)；③72 ℃再延伸10 min。基因組DNA提取及PCR擴增試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。純化后的PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進行正、反向測序。在Blast上比對測序結(jié)果與美國NCBI基因文庫的PROC基因序列，找尋突變位點。選擇100個個體以排除多態(tài)性。家系成員基因檢測僅限先證者基因突變區(qū)域。

1.2.4 FV Leiden突變和凝血酶原20210G＞A突變檢測：對先證者的F5基因第10外顯子和F2基因第14外顯子進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接測序分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)生物學特性分析：用ClustalX-2.1-win判斷突變氨基酸在物種進化過程中的保守性。用PolyPhen-2評估突變氨基酸對PC功能和/或結(jié)構(gòu)的可能影響。通過Swiss-PdbViewer軟件和PIC程序分析突變引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標檢測結(jié)果 先證者、其兒子和二姐的血漿PC∶A與PC∶Ag均平行下降，為39%～58%。先證者的D-D為20.0 mg/L。先證者的母親、大姐和丈夫的PC和D-D均在正常范圍內(nèi)。所有家庭成員的PS∶A和AT∶A都正常。見表1。

2.2 基因突變檢測結(jié)果 先證者、其兒子和二姐均在PROC基因的9號外顯子攜帶c.997G＞A雜合錯義突變，導致p.Ala291Thr，家系其他成員均為野生型（見圖2及表1）。該基因型結(jié)果與血漿PC表型結(jié)果一致。在100個對照個體中未檢測到此突變，初步排除基因多態(tài)性可能，經(jīng)查閱文獻和人類基因突變數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)其為新的突變。

表1 遺傳性PC缺陷癥家系成員表型及基因型檢測結(jié)果

圖2 PROC基因第9外顯子測序結(jié)果

2.3 蛋白質(zhì)生物學特性分析 同源序列比對結(jié)果表明Ala291在9種同源物種中不是高度保守。Poly-Phen-2軟件評分為0.850，提示“可能有害的”。蛋白質(zhì)模型分析顯示：在野生型PC中，非極性疏水的Ala291不與其他氨基酸連接。突變?yōu)闃O性親水的Thr291后，Thr291與Pro327之間新增一氫鍵，導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變（見圖3）。

圖3 PC蛋白質(zhì)模型圖

3 討論

PC系統(tǒng)是體內(nèi)重要的生理性抗凝系統(tǒng)，PC活化后與輔助因子蛋白S結(jié)合，滅活活化的凝血因子V（FVa）和活化的凝血因子V III（FV IIIa），限制凝血酶的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗凝作用。PC缺陷癥常導致血栓形成，通常表現(xiàn)為靜脈血栓，而且PC水平越低，血栓形成的趨勢越高[4]。國外研究表明雜合子PC缺陷癥在有遺傳性血栓形成傾向的家庭和健康人口中的發(fā)生率分別為6%和0.2%[5-6]。在中國，PC缺陷癥在靜脈血栓患者的患病率約為8%[7]。本研究中，先證者因左腿深靜脈血栓入院，輔助檢查發(fā)現(xiàn)血漿PC∶A為39%，PC∶Ag為45%?；蚍治鲲@示PROC基因第9號外顯子存在c.997G＞A雜合突變，導致p.Ala291Thr突變。其兒子和二姐亦存在該雜合突變。排除FV Leiden突變和凝血酶原20210G＞A突變等其他因素，診斷為I型遺傳性PC缺陷癥。根據(jù)家系圖的顯示，推測此突變遺傳自其父親，由于先證者父親已故未能采集到樣本。家系成員中，先證者、其兒子和二姐均攜帶p.Ala291Thr雜合突變，兒子和二姐無靜脈血栓形成臨床表現(xiàn)，而先證者具有嚴重的復發(fā)性靜脈血栓栓塞，可能原因是先證者同時患有SLE，APC抵抗加劇了血栓形成[8]。PROC基因缺陷患者是否出現(xiàn)血栓形成臨床癥狀可能是多種環(huán)境因素（如妊娠、外傷、服用避孕藥、吸煙、長期制動等）與基因突變共同作用的結(jié)果[9]。

PC缺陷癥按照產(chǎn)生的原因不同可分為遺傳性PC缺陷癥和獲得性PC缺陷癥。遺傳性PC缺陷癥通常由PROC基因突變所致。PROC基因位于2號染色體2q13-q14，包括9個外顯子和8個內(nèi)含子。外顯子9區(qū)由886個堿基組成，前590個堿基編碼PC第224至第419位氨基酸，均在重鏈區(qū)，主要為C端絲氨酸蛋白酶區(qū)域，是PC的活性區(qū)域[10]。該家系攜帶的p.Ala291Thr雜合錯義突變位正發(fā)生于此區(qū)，可能影響PC活性。進一步研究表明，Ala291位于PROC基因的催化結(jié)構(gòu)域（催化三聯(lián)體：H211-D257-S360），其主要包括Ca2+結(jié)合環(huán)（殘基225-235）和自溶環(huán)（殘基302-317）[11]。自溶環(huán)有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活化肽，在APC的抗凝血功能中起關(guān)鍵作用，在Ca2+結(jié)合環(huán)的共同作用下水解滅活FVa[12]。蛋白質(zhì)模型分析顯示Ala291位于自溶環(huán)附近的催化區(qū)域。Ala291被Thr291取代后，Thr291與Pro327形成額外的氫鍵，形成的超強分子間力可能會擾亂催化活性，導致PC活性的降低。

綜上所述，本研究中我們對1個遺傳性PC缺陷癥家系進行實驗室表型和基因型進行檢測，發(fā)現(xiàn)了p.Ala291Thr雜合錯義突變，并通過生物學分析軟件初步探討了其可能的分子致病機制，認為該家系PC水平減低與p.Ala291Thr雜合錯義突變有關(guān)，但其確切的分子致病機制有待進一步研究。