牛燕，周怡，鄭宏，趙良才，李晨，高紅昌

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率位居第三，致死率位居第四[1]。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[2]。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)表型，是結(jié)直腸癌患者病死的主要原因之一。而異常的代謝模式是惡性腫瘤的另一重要特征[3]，多項(xiàng)研究[4-6]表明代謝方式的改變參與腫瘤轉(zhuǎn)移?；诤舜殴舱駳渥V（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H NMR）的代謝組學(xué)方法，能定性、定量分析代謝物水平，已廣泛用于篩選疾病發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志物，探討發(fā)病機(jī)制和藥物動(dòng)力學(xué)研究等[7-8]。本研究基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)，探索SW480、SW620兩種不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞的代謝模式，為進(jìn)一步篩選結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物和尋找新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW620和低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW480購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。PMI Modified Medium培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，磷酸鹽緩沖液購(gòu)自北京Solarbio公司，0.25%Trypsin購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，三甲硅烷基丙磺酸鈉（TSP）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，D2O（99.9%氘代）購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室，谷氨酰胺LGlutamine、葡萄糖D-（+）-Glucose Solution購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，NaOH購(gòu)自美國(guó)Acros Organics公司，XF Base Medium Minimal基礎(chǔ)培養(yǎng)液、XF Calibrant校準(zhǔn)液、Seahorse XF細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試試劑盒、Seahorse XF糖酵解壓力測(cè)試試劑盒購(gòu)自美國(guó)Seahorse Bioscience公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GEMINI公司。

1.2 主要儀器 Bruker AVANCE III 600 MHz NMR波譜儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司，Seahorse XF96細(xì)胞能量代謝分析儀購(gòu)自美國(guó)Seahorse Bioscience公司，無(wú)CO2培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，超凈臺(tái)購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，冷凍干燥機(jī)購(gòu)自德國(guó)Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)：采用來(lái)自同一親本、遺傳背景一致的人結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW620和低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW480。用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI Modified Medium培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞樣本收集及胞內(nèi)代謝物提?。禾幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480和SW620細(xì)胞用15 mL冰0.9%氯化鈉溶液快速洗2遍，終止代謝；加15 mL Hank’s平衡液洗1遍；加2.5 mL胰酶消化，終止消化，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中；2 000 r/min，4 ℃，離心5 min，收集細(xì)胞沉淀；加5 mL Hank’s平衡液再2 000 r/min，4 ℃，離心5 min，棄上清；加冰甲醇∶氯仿=2∶1（300 μL+150 μL），超聲冰上破碎30 min；加冰氯仿∶水=1∶1（225 μL+225 μL），渦旋1 min，置于冰上15 min；12 000 r/min，4 ℃，離心20 min；取上清液，凍干48 h。

1.3.31H NMR樣本的制備和圖譜采集：SW480和SW620細(xì)胞代謝物提取凍干粉末中加500 μL含TSP濃度為0.05 mmol/L的D2O，震蕩15 s至完全溶解，置于4 ℃，12 000×g條件下離心10 min，取上清490 μL，移入直徑為5 mm的NMR樣品管。使用Bruker AVANCE III 600 MHz NMR譜儀進(jìn)行檢測(cè)。采用單脈沖序列，預(yù)飽和法壓制殘余水峰。為了能夠?qū)Υx物的1H NMR進(jìn)行定量分析，試驗(yàn)中脈沖翻轉(zhuǎn)角為90°，采樣點(diǎn)數(shù)32 K，累加次數(shù)1 024次，弛豫延遲為4 s，實(shí)驗(yàn)溫度為298.0 K?；诙嗑SNMR技術(shù)，結(jié)合本課題組以前發(fā)表的工作[9-12]，以及NMR Suite軟件（加拿大Chenomx公司）和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Metabo-lome Database，www.hmdb.ca）對(duì)采集的譜圖中的代謝物進(jìn)行詳細(xì)確認(rèn)。

1.3.4 譜圖處理：為了得到更多的代謝相關(guān)信息并且更直觀也更客觀地發(fā)現(xiàn)組間差異代謝物，采用Bruker Topspin 2.1軟件將所有樣本的譜圖導(dǎo)成數(shù)據(jù)，然后應(yīng)用MATLAB R2013b軟件（美國(guó)Mathworks公司）對(duì)所有樣本1H NMR譜圖積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行位置校正，為了消除飽和水峰時(shí)引起的譜線扭曲，除去預(yù)飽和壓水峰后的殘留水峰區(qū)。之后將積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+12.0軟件包（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。PLS-DA的第一主成分（principal component 1，PC1）和第二主成分（principal component 2，PC2）可以代表矩陣中最大的信息變量，Q2代表模型的預(yù)測(cè)能力。其構(gòu)建的得分圖上的每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本的代謝模式，相應(yīng)的載荷圖反映積分區(qū)間對(duì)分組的貢獻(xiàn)[13-14]。

1.3.5 Seahorse XF96細(xì)胞能量代謝分析：使用Seahorse XF96細(xì)胞能量代謝分析儀測(cè)量線粒體耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）和細(xì)胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)呼吸、線粒體呼吸、糖酵解。在XF96細(xì)胞培養(yǎng)板上接種SW480和SW620細(xì)胞，4×104個(gè)/孔，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在測(cè)定前1 h，在37 ℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱中，更換培養(yǎng)基為含有11 mmol/L葡萄糖和2.05 mmol/L谷氨酰胺的無(wú)碳酸氫鹽的XF Base Medium Minimal 1640。Seahorse測(cè)量板A孔中加入寡霉素（Oligomycin，1.0 μmol/L），B孔中加入羰基-氰-對(duì)-三氟甲氧基苯腙（FCCP，1.0 μmol/L），C孔加入抗霉素A和魚藤酮的組合抑制劑（Rot/AA，0.5 μmol/L），測(cè)定細(xì)胞OCR水平[15-16]。對(duì)于ECAR的檢測(cè)，需首先測(cè)定含葡萄糖（11 mmol/L）時(shí)的基礎(chǔ)糖酵解速率和線粒體呼吸產(chǎn)生的酸化速率；板內(nèi)加入Rot/AA（0.5 μmol/L）記錄細(xì)胞的最大代償性糖酵解能力；再加入2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG，50 mmol/L），記錄糖酵解儲(chǔ)備能力，計(jì)算細(xì)胞ECAR水平[17]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞裂解物1H NMR譜歸屬結(jié)果 通過(guò)1H NMR譜可以同時(shí)獲得結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和SW620的多種水溶性小分子代謝物信息，包括：異亮氨酸/亮氨酸（δ0.95）、纈氨酸（δ1.02）、乳酸（δ1.33，δ4.10）、丙氨酸（δ1.47）、乙酸（δ1.91）、谷氨酸（δ2.36）、琥珀酸（δ2.40）、谷氨酰胺（δ2.46）、谷胱甘肽（δ2.52）、肌酸（δ3.03，δ3.90）、氧化磷酸膽堿（δ3.19）、牛磺酸（δ3.25，δ3.40）、甘氨酸（δ3.55）、葡萄糖（δ4.65，δ5.24）、肌苷（δ6.08）、延胡索酸（δ6.50）、ATP（δ6.14）、酪氨酸（δ6.89，δ7.20）、苯丙氨酸（δ7.39）。見(jiàn)圖1。

圖1 SW480細(xì)胞（A）和SW620細(xì)胞（B）典型的1H NMR譜

2.2 PLS-DA分析結(jié)果 原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和高轉(zhuǎn)移潛能SW620細(xì)胞的代謝模式能夠在第一主成分上明顯分開(kāi)（R2X=0.736，R2Y=0.985，Q2=0.97，見(jiàn)圖2A），對(duì)應(yīng)的模式置換圖也顯示所建立的PLSDA模型是可行的（見(jiàn)圖2B）。從第一主成分相應(yīng)的載荷圖中可以看出支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA，即亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）、乳酸、丙氨酸、乙酸、葡萄糖、肌苷、延胡索酸等代謝物對(duì)2組細(xì)胞代謝模式的區(qū)分有較大的貢獻(xiàn)，對(duì)應(yīng)的顏色越紅表示其貢獻(xiàn)越大（見(jiàn)圖2C）。

2.3 代謝物定量分析 與原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480相比，具有高轉(zhuǎn)移潛能的SW620細(xì)胞中葡萄糖代謝相關(guān)的代謝物乳酸顯著升高；氨基酸代謝中，異亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸水平升高，乙酸、?；撬崴斤@著降低（P＜0.05）；能量代謝相關(guān)的代謝物氧化磷酸膽堿、ATP、肌苷顯著下降，琥珀酸顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 Seahorse XF96細(xì)胞能量代謝分析 根據(jù)Seahorse中Mito-Stress結(jié)果，具有高轉(zhuǎn)移潛能的SW620細(xì)胞OCR水平較高（見(jiàn)圖4）。具體變化為：基礎(chǔ)呼吸（即細(xì)胞在加寡霉素刺激之前的OCR值）和偶聯(lián)ATP產(chǎn)生的呼吸（即基礎(chǔ)呼吸OCR值和加入FCCP刺激之前的OCR值之差）。SW480和SW620細(xì)胞之間這2種呼吸并沒(méi)有顯著差異，而具有高轉(zhuǎn)移潛能的SW620細(xì)胞最大呼吸能力顯著升高（P＜0.01），即加入FCCP之后至加Rot/AA之前OCR最大值與加入寡霉素之后OCR最低值之差。同時(shí)，SW620細(xì)胞呼吸儲(chǔ)備能力也顯著升高（P＜0.01），質(zhì)子漏耗氧率升高，即細(xì)胞呼吸過(guò)程轉(zhuǎn)化為熱量的氧消耗量非線粒體呼吸耗氧量降低，說(shuō)明高轉(zhuǎn)移潛能的SW620細(xì)胞更傾向于線粒體呼吸方式?？偠灾?，SW620細(xì)胞呼吸異常升高同時(shí)釋放出更多的熱量。

葡萄糖是細(xì)胞糖酵解的能量來(lái)源，能促進(jìn)細(xì)胞的糖酵解，其終產(chǎn)物是乳酸，從而提高細(xì)胞ECAR，XF Glycolytic Rate Assay明確SW620的ECAR水平較高。具體變化為：我們定義基礎(chǔ)糖酵解為加入Rot/AA之前的ECAR值，它代表細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力和細(xì)胞代謝的活力；當(dāng)加入Rot/AA后，細(xì)胞有氧呼吸被抑制，所得的ECAR值代表細(xì)胞最大糖酵解代償能力，當(dāng)再加入2-DG后，糖酵解途徑被抑制，ECAR值下降，證明所得的ECAR值是由細(xì)胞糖酵解所引起的，它代表細(xì)胞的糖酵解能量代謝水平和能力（見(jiàn)圖5）。這一結(jié)果與1H NMR譜圖結(jié)果中檢測(cè)到SW620細(xì)胞內(nèi)乳酸水平升高一致，均表明SW620細(xì)胞糖酵解能力顯著升高。

圖2 2種細(xì)胞1H NMR譜的PLS-DA分析結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，研究表明，代謝模式的異常與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-6]。研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程的代謝模式，進(jìn)一步了解結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制，可為其提供診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

在本研究中，我們以不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細(xì)胞株作為研究對(duì)象，應(yīng)用1H NMR技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW480、SW620細(xì)胞的代謝模式存在明顯不同，多種代謝物的水平在2種細(xì)胞株中有顯著差異。

腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移需要大量能量，與SW480相比，高轉(zhuǎn)移潛能的SW620細(xì)胞中乳酸等水平顯著升高。多項(xiàng)研究表明腫瘤細(xì)胞有較高含量的乳酸，其誘導(dǎo)的酸性環(huán)境能夠抵抗細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18-19]。琥珀酸水平在SW620細(xì)胞中也顯著升高，LU等[20]發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)中間體在不同轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞中有顯著差異，其含量隨轉(zhuǎn)移潛能增加而增加。為了進(jìn)一步探討不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株的能量代謝，本研究通過(guò)使用Seahorse細(xì)胞代謝能量分析儀測(cè)定ECAR水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞的基礎(chǔ)糖酵解水平較高，該結(jié)果與NMR檢測(cè)到乳酸水平升高相對(duì)應(yīng)，也與SIMES等[19]在乳腺癌中的研究結(jié)果相一致。此外，OCR的活性也被證明與多種腫瘤的侵襲能力相關(guān)[21-22]，我們的結(jié)果也顯示高轉(zhuǎn)移能力的SW620具有較高水平的OCR。

氨基酸參與多種生化反應(yīng)，CHEN等[23]指出，與健康人相比，結(jié)直腸癌患者的多種氨基酸如丙氨酸、谷氨酸、色氨酸、甘氨酸等水平顯著升高。MONTROSE等[24]指出結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程中氨基酸水平都有階段性改變。我們發(fā)現(xiàn)丙氨酸水平在SW620中較高，這與高轉(zhuǎn)移潛能的4T1細(xì)胞相一致[19]。此外，高轉(zhuǎn)移潛能的SW620細(xì)胞中谷氨酰胺水平顯著升高。谷氨酰胺是合成核苷酸、氨基酸和ATP的必要底物，也是TCA循環(huán)的主要前體，谷氨酰胺成癮在腫瘤細(xì)胞中較常見(jiàn)[25]。SINGH等[26]指出侵襲性高的細(xì)胞株中谷氨酰胺成癮與細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

圖3 SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞的代謝通路圖

圖4 2種細(xì)胞OCR水平測(cè)定結(jié)果

圖5 2種細(xì)胞ECAR水平測(cè)定結(jié)果

綜上所述，本研究運(yùn)用1H NMR技術(shù)并結(jié)合Seahorse XF96分析不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞株的代謝模式，兩者代謝模式存在顯著差異，與SW480細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移潛能高的SW620細(xì)胞具有更高的糖酵解水平、TCA循環(huán)活性、氨基酸水平、ECAR和OCR水平。SW620中較高的代謝基礎(chǔ)潛能，提示其高轉(zhuǎn)移能力的能量需要，也能更快適應(yīng)其所在微環(huán)境。