李佳萍，江燕，王豆豆，余方芳，程躍躍，劉哲

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 超聲影像科，浙江 溫州 325027）

納米級超聲造影劑具有體積小，可以自由通過血管內(nèi)皮，在血液循環(huán)中穩(wěn)定性強[1]，較強的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）的獨特優(yōu)點，這為納米泡靶向診斷和治療血管外病變組織的應(yīng)用提供了理論依據(jù)[2-3]。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和超聲成像（ultrasond，US）由于分別具有較高的空間分辨率和較好的實時成像能力，被認(rèn)為是2種互補的成像技術(shù)[4]。在本研究中，我們利用聚氰基丙烯酸丁酯（poly butyl cyanoacrylate，PBCA）乳化聚合物和超順磁性氧化鐵（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）納米粒子為原料，開發(fā)了聚合物納米氣泡，并研究了其在超聲下的信號強度。

1 材料和儀器

1.1 材料 氰基丙烯酸丁酯（butyl cyanoacrylate，BCA）購于德國Sichel Werke公司，三氯化鐵（FeCl3）、四水氯化鐵（FeCl2·4H2O）、Triton X-100和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidon，PVP）購于美國Sigma-Aldrich公司，明膠購自德國Merck公司，氫氧化銨溶液（ammonium hydroxide solution，NH3·H2O，25%）購于北京百靈威公司。

1.2 儀器 Heraeus Multifuge離心機(jī)（美國Thermo Fischer公司），IKA-T25分散機(jī)（德國IKA公司），Elan-DRCII電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Perkin Elmer公司），Beckmann計數(shù)器（美國Beckmann公司），Vevo2100超聲掃描儀（加拿大Visualsonics公司）。

2 方法

2.1 不同粒徑氣泡的制備 在含有0.02%表面活性劑Tri-tonx-100的酸性水溶液（pH=2.5）中加入單體BCA，攪拌1 h后形成微泡懸浮液，合成了PBCA微氣泡。懸浮液經(jīng)過浮懸過程，將充滿空氣的微氣泡與無空氣的微氣泡分離。將充滿空氣的PBCA微氣泡轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，用離心機(jī)以500～10 000 r/min的速度進(jìn)行離心后得到PBCA納米氣泡。研究不同的離心條件之下得到的氣泡的粒徑大小。

2.2 含鐵聚合物納米氣泡（UPNBs）的制備 取300 mL去離子水和Triton X-100（3 mL，5.0 mmol/mL）放置于燒杯中在室溫下攪拌，向燒杯中滴加鹽酸（1 mol/mL）調(diào)節(jié)pH值至2.5。隨后，將10 mL預(yù)先制備的USPIO納米粒子懸浮液加入混合物中，攪拌2 min后，用注射器滴加28.3 mmol/L BCA 3 mL，然后在室溫下機(jī)械攪拌（4 000 r/min）1 h。混合液靜置至泡沫沉降后，將乳化液轉(zhuǎn)移到1 L分離漏斗中，重力浮選4 d。丟棄底部的清澈溶液，上層固體泡沫被重新懸浮在0.02%的Tritonx-100（pH=7.0）中。該工藝重復(fù)3次后，進(jìn)行離心，純化UPNBs懸浮液。500 r/min離心UPNBs懸浮液20 min，收集上層白色凝固氣泡，再將其分散于0.02% Tritonx-100溶液（pH=7.0，50 mL）中，重復(fù)3次后保存于4 ℃。

2.3 UPNBs的表征 用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定不同配料所制備的納米氣泡中鐵的含量，每批測定一式三份，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1%。用計數(shù)器分析UPNBs的平均直徑和濃度。

2.4 US檢測 將不同粒徑氣泡（40個/mL）分散于2.5%（w/v）明膠水溶液中制備成超聲體模，明膠固定在成像面板上，換能器（中心頻率為25 MHz）垂直定位于明膠體模。首先在一個預(yù)定好的4.5 s連續(xù)成像模式中運行超聲成像，然后用一個破壞性脈沖（高機(jī)械指數(shù)）來測量背景信號。在凝膠體模上隨機(jī)選取5個不同位置（15 mm×15 mm）作為感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），分別測量PBCA-納米氣泡、PBCA微泡和UPNB聚合氣泡被破壞前后的信號強度（signal intensity，SI）變化趨勢。對比強度（contrast intensity，CI）是通過從總SI（氣泡破壞前）中扣除背景信號（氣泡被破壞后）來計算的。

3 結(jié)果和討論

3.1 氣泡制備方法的優(yōu)化 前期報道指出由于材料和制備工藝的不同，氣泡在粒徑和成像效果上有很大的差異[5-6]。在本研究中，我們首先采用一鍋乳化聚合法把PBCA制備成氣泡，然后采用簡單的機(jī)械攪拌法制備納米氣泡[7]。如表1所示，隨著攪拌速度從500 r/min增加到10 000 r/min，氣泡的尺寸從納米級（45 nm）變?yōu)槲⒚准墸?.34 μm），因此可以通過調(diào)整攪拌速度來制備不同尺寸的氣泡，以滿足超聲造影的不同需求。通過對攪拌所形成的氣泡進(jìn)行再離心，氣泡尺寸從2.34 μm減小到900 nm，且隨著離心時間的增加，氣泡尺寸呈現(xiàn)出一個平臺，這說明用這種方法獲得更小的氣泡是不可行的，見表2。重要的是，納米氣泡和微泡都表現(xiàn)出長期穩(wěn)定性，微泡的大小在12個月內(nèi)從2.34 μm變化到2.11 μm，納米氣泡的大小在4個月內(nèi)從197.2 nm變?yōu)?09.2 nm。此結(jié)果也與VAN EETEN等[8]的發(fā)現(xiàn)相符合，即氣泡的平均尺寸受旋轉(zhuǎn)速度、氣體流量、流體密度和黏度的影響。納米氣泡于2004年首次應(yīng)用于超聲波，OEFFINGER等[2]開發(fā)出一種含有全氟丙烷的納米級造影劑，其粒徑大小為380 nm至780 nm，并有良好的超聲波對比度。這些具有納米級尺寸的氣泡被定義為納米氣泡。它可以向腫瘤組織內(nèi)滲出。由于腫瘤血管缺乏緊密連接，納米氣泡可在腫瘤組織中積累從而實現(xiàn)被動靶向成像[9-10]。另一方面，通過表面修飾，納米氣泡也可以識別腫瘤表面的特定分子，并與其結(jié)合，實現(xiàn)主動靶向成像或腫瘤特異性成像。因此，納米氣泡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11]。微泡作為超聲分子成像的造影劑和載體，它被用作血池造影劑難以通過病變組織的血管壁，因此盡可能減少微泡大小使之能夠透過血管壁到達(dá)組織是非常必要的[12]。

表1 不同攪拌速度下氣泡粒徑的大小

表2 不同離心時間下氣泡粒徑的大小

3.2 不同粒徑氣泡在超聲成像中的信號強度 采用超聲體模成像技術(shù)，研究了超聲場中不同大小氣泡的增強效果。通過計算CI來定量評價它們在超聲波中產(chǎn)生背向散射信號的能力。結(jié)果顯示，粒徑為45 nm的氣泡具有極弱的信號，隨著氣泡粒徑增加，超聲信號逐漸增加，當(dāng)氣泡粒徑增加至312.2 nm時，其產(chǎn)生的信號與微泡（2.34 μm）產(chǎn)生的信號相當(dāng)，見圖1。這證實了氣泡粒徑尺寸越小，背向散射信號越弱[13]，同時說明了適當(dāng)粒徑的納米氣泡可具有微泡成像信號強的優(yōu)點。對比增強超聲是利用造影劑增強病變與周圍組織之間的超聲回波信號，檢測和診斷疾病的技術(shù)[14]。

圖1 不同尺寸納米氣泡在超聲體模實驗中的成像對比強度

3.3 不同含鐵濃度的UPNBs的表征 為了實現(xiàn)MRI/US雙重成像，必須為MRI和US模式開發(fā)一種對比劑[15-16]。SONG等[17]構(gòu)建了具有MR T2成像功能和US圖像對比度的超順磁性自組裝微泡（superparamagnetic self-assembled microbubbles，SAMBs）作為MRI/US雙重造影劑，新型造影劑在體內(nèi)具有良好的生物相容性。因此，構(gòu)建一種應(yīng)用于MRI/US的混合造影劑是可以實現(xiàn)的，但大多數(shù)研究[18]都使用微米級的氣泡作為雙重造影劑的基礎(chǔ)，而后者僅限于血液池。因此，制備納米級別的雙重造影劑是必要且可行的[19]。

本研究結(jié)果顯示了4 000 r/min攪拌速度制備的不同鐵含量的UPNBs的性質(zhì)。當(dāng)雜化氣泡中鐵的含量越高，水溶液顏色越暗。雜化氣泡里鐵的含量為3.76 mg/L時，其粒徑為342 nm，當(dāng)鐵含量增加至44.92 mg/L時，其粒徑為346 nm，只有小幅度的變化，這說明了鐵的含量對聚合氣泡粒徑大小沒有明顯的影響。把含鐵量不同的雜化氣泡制備成成像體模，在相同超聲成像條件下，與單純的PBCA納米氣泡相比，鐵含量不同的納米氣泡產(chǎn)生了相似的背向散射信號。這表明純納米氣泡是超順磁性氧化鐵合適的載體，含鐵的雜化氣泡有良好的背向散射能力，這使得UPNBs可以作為核磁共振與超聲雙模態(tài)成像的造影劑。見圖2。

表3 不同批次納米氣泡粒徑大小和鐵含量

圖2 不同含鐵量的聚合物鈉米氣泡在超聲體模中的成像對比強度

綜上所述，本研究提出了一種適用于不同尺寸納米氣泡的機(jī)械攪拌方法，并對其超聲成像性能進(jìn)行了表征，在4個多月的時間里，納米氣泡在溶液中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。體模實驗證明單純納米氣泡與聚合納米氣泡均適用于超聲成像，更重要的是，UPNBs作為混合成像劑，可能是MRI引導(dǎo)下的藥物和基因傳遞的潛在載體。