周玉平，楊萍，唐春蘭，璩輝，呂雪幼，胡桂梅

（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 寧波 315020；2.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，浙江寧波 315100；3.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，浙江 寧波 315211）

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌、肝衰竭方向發(fā)展過程中的共同病理階段。我國是肝病大國，尤其是慢性乙肝患者數(shù)量巨大，脂肪肝等非感染性慢性肝病也日趨增多，因而在我國防治肝纖維化的任務(wù)尤為艱巨[1-2]。雖然關(guān)于肝纖維化的基礎(chǔ)和臨床研究取得了諸多進(jìn)展，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)干預(yù)肝纖維化進(jìn)展仍局限于病因?qū)W的治療，臨床上仍缺乏抗肝纖維化的有效化學(xué)或生物藥物[3]。中醫(yī)藥是解決肝纖維化難題的有效途徑。黃芪總皂苷（astragalosides，AST）是黃芪的主要藥效成分，具有顯著的抗肝纖維化作用，但其效應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)合分子生物學(xué)領(lǐng)域非編碼RNA的最新研究成果，從環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）角度在轉(zhuǎn)錄水平解析AST抗肝纖維化作用機(jī)制。課題組前期通過circRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，mmu_circ_34116是肝纖維化模型肝組織中變化最為顯著的circRNA，但AST是否能調(diào)節(jié)circRNA表達(dá)尚未見報道，本研究擬初步探討AST對其表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 C57BL/6雄性小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實驗動物中心。本研究獲得寧波大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。AST，批號H-045-160721，純度98.87%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司。索拉菲尼，批號S5080，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 四氯化碳（CCl4）分析純購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。蘇木精、麗春紅、苯胺藍(lán)均購自美國Sigma公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、白蛋白（albumin，ALB）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RNA-hold液購自北京全式金生物公司。TRIZOL購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System、實時熒光定量PCR試劑盒GoTaq?qPCR Master Mix購自美國Promega公司。Agilent-Mx3005P實時熒光定量PCR儀為美國安捷倫公司產(chǎn)品。PCR小鼠引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 動物造模和標(biāo)本取材 實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為正常組、CCl4模型組、CCl4+AST組、CCl4+索拉菲尼組，每組8只。除正常組外的小鼠按

表1 PCR所用引物序列

1.4 肝組織病理學(xué)觀察 制作肝組織石蠟切片，行HE染色和Masson染色，觀察組織炎癥和膠原增生情況。組織切片由2位病理專家盲法閱片。Masson染色時，膠原纖維呈藍(lán)色或深藍(lán)色，用Image-Pro Plus 6.0軟件測量膠原纖維的面積，每個樣本取5個視野，計算每個標(biāo)本的膠原纖維總面積（μm2）。

1.5 血清肝功能檢測 采用試劑盒法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.6 Real time PCR Trizol法提取小鼠肝組織總RNA，取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（20 μL體積），5倍稀釋后-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，條件設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；40個PCR循環(huán)（95 ℃變性10 s，60 ℃退火60 s）。經(jīng)內(nèi)參GAPDH校正，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量。輕，見少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組肝組織炎癥反應(yīng)病理結(jié)果比較 HE染色顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周放射，中央靜脈、匯管區(qū)動靜脈以及膽管結(jié)構(gòu)正常；CCl4模型組小鼠肝細(xì)胞廣泛壞死，匯管區(qū)可見大量的炎性細(xì)胞浸潤；與CCl4模型組比較，CCl4+AST組和CCl4+索拉菲尼組小鼠肝細(xì)胞壞死較體質(zhì)量以15% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，共5周，正常組不處理。

根據(jù)課題組前期工作基礎(chǔ)，CCl4+AST組每天給藥劑量為164 mg/kg，CCl4+索拉菲尼每天劑量為4 mg/kg，藥物用蒸餾水溶解，配置成合適混懸液灌胃。正常組和CCl4模型組以等體積蒸餾水灌胃，自造模第3周首日開始灌胃給藥，每日1次，給藥3周。5周末采集小鼠肝臟，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，下腔靜脈采血，切取肝臟最大葉放入4%多聚甲醛固定用于石蠟切片；其余肝組織投入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 4組肝組織膠原沉積結(jié)果比較 正常組小鼠僅在肝臟的匯管區(qū)以及中央靜脈周圍見少量膠原纖維；CCl4模型組小鼠纖維間隔增寬致密，形成大小不一的完整假小葉結(jié)構(gòu)；與CCl4模型組比較，CCl4+AST組和CCl4+索拉菲尼組小鼠肝組織膠原纖維間隔明顯變窄、減少，少見完整的假小葉結(jié)構(gòu)，見圖2。膠原纖維面積半定量分析結(jié)果顯示：與正常組比較，CCl4模型組膠原面積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與CCl4模型組比較，CCl4+AST組、CCl4+索拉菲尼組膠原面積顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

2.3 4組血清肝功能指標(biāo)的比較 與正常組比較，CCl4模型組血清ALT、TBil水平均顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而ALB水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與CCl4模型組比較，CCl4+AST組和CCl4+索拉菲尼組ALT、TBil活性均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；ALB水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 4組肝組織mmu_circ_34116表達(dá)水平的比較與正常組比較，CCl4模型組肝組織mmu_circ_34116表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與CCl4模型組比較，CCl4+AST組mmu_circ_34116表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與CCl4模型組比較，CCl4+索拉菲尼組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 4組肝組織炎癥反應(yīng)的病理結(jié)果（HE染色）

圖2 4組對肝組織膠原沉積的病理結(jié)果比較（Masson染色）

表2 4組肝組織膠原沉積、血清肝功能指標(biāo)和mmu_circ_34116表達(dá)水平的比較（每組n=8，

表2 4組肝組織膠原沉積、血清肝功能指標(biāo)和mmu_circ_34116表達(dá)水平的比較（每組n=8，

與正常組比：aP＜0.01；與CCl4模型組比：bP＜0.01，cP＜0.05

正常組 1 070.0± 768.4 24.85±2.28 7.53±0.83 29.13±2.03 2.21±0.13 CCl4模型組 29 116.6±12 633.8a 57.07±5.96a 13.72±1.09a 27.58±1.20 0.34±0.11a CCl4+AST組 13 252.1± 4 205.6b 43.71±1.33b 10.63±1.12b 29.18±1.17 1.16±0.21b CCl4+索拉菲尼組 17 062.1± 3 674.3c 35.01±2.59b 9.45±0.65b 28.08±1.23 0.41±0.15 F 22.246 212.221 59.944 2.361 253.225 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.093 ＜0.01

3 討論

中醫(yī)藥防治肝纖維化、肝硬化歷史悠久，臨床和基礎(chǔ)研究均顯示出了其良好的前景[4]。中醫(yī)學(xué)無肝纖維化和肝硬化病名，根據(jù)其臨床特點，肝纖維化多屬于中醫(yī)“脅痛”“積聚”范疇[5]，正虛血瘀是本病的基本病機(jī)特點。張華等[6]結(jié)合古典文獻(xiàn)研究及近現(xiàn)代名中醫(yī)認(rèn)識，在深入系統(tǒng)的臨床和基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)上，提出了“血瘀為積之標(biāo)，虛損乃積之本”的“虛損生積”病機(jī)學(xué)說，得到了學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可。黃芪為膜莢黃芪的根，具有補氣固表、托毒生肌、利水等功效?！侗静菥V目》謂之“可治一切氣衰血虛之證”，與肝硬化“虛損生積”病機(jī)特點相對應(yīng)，是臨床防治肝硬化方劑如黃芪湯、當(dāng)歸補血湯、861方等名方的主藥。馬紅等[7]通過動物實驗證實了單味黃芪對肝纖維化具有良好的治療作用。AST是黃芪的主要有效成分[8]，屬于單味藥物的組分復(fù)方配伍形式。有研究報道，AST在體內(nèi)能抑制多種動物模型的肝纖維化進(jìn)展[9-10]。本研究通過經(jīng)典的CCl4小鼠模型的干預(yù)實驗，再次證實AST能顯著抑制肝纖維化的進(jìn)展，與上述文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。

近年來，隨著RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)了ncRNA家族的新成員circRNA，研究證實，circRNA在人類細(xì)胞中廣泛存在，并且在調(diào)控人類基因中潛能巨大，circRNA的研究成了ncRNA研究領(lǐng)域的最新焦點之一，circRNA的生物學(xué)功能研究進(jìn)展迅速[11]。目前對于circRNA與疾病的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，circRNA與肝臟疾病的研究目前報道不多，已有的研究主要集中在原發(fā)性肝癌領(lǐng)域[12]。本課題組報道了小鼠肝纖維化模型肝組織circRNA的表達(dá)譜變化，通過基因芯片技術(shù)初步篩選出了肝組織差異表達(dá)的circRNA共有69個，其中mmu_circ_34116是變化最為顯著的circRNA之一，CCl4模型組表達(dá)比正常組降低了4.67倍，提示其可能與肝纖維化發(fā)病機(jī)制有關(guān)，有可能是藥物干預(yù)的靶標(biāo)[13]。

本課題組進(jìn)一步研究證實，mmu_circ_34116與肝星狀細(xì)胞的活化有關(guān)，敲低肝星狀細(xì)胞中mmu_circ_34116的表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞的活化，這提示mmu_circ_34116可能是抗肝纖維化的有效靶點[14]。本研究通過小鼠肝纖維化模型證實，mmu_circ_34116在模型中均顯著降低。同時，我們通過AST的干預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，AST能顯著提高模型組降低的mmu_circ_34116的表達(dá)水平，我們推測這可能是AST抗肝纖維化在轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)制之一。此外，我們發(fā)現(xiàn)陽性對照藥索拉菲尼雖然也有較好的抗肝纖維化作用，但對mmu_circ_34116表達(dá)卻無顯著影響，這提示索拉菲尼的干預(yù)環(huán)節(jié)可能與circRNA這一轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機(jī)制無關(guān)，而是作用于轉(zhuǎn)錄后環(huán)節(jié)如mRNA的翻譯、信號通路蛋白的調(diào)控等環(huán)節(jié)[15-16]。這也從另一方面說明，中藥組分在抗肝纖維化效應(yīng)方面具有多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點的優(yōu)勢。