潘麗蛟，關(guān)文靈，李懿航

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)資產(chǎn)管理處，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；3.昆明冶金高等專科學(xué)校后勤管理處，云南 昆明 650201)

中甸刺玫Rosa praelucens為薔薇科薔薇屬落葉灌木，是中國云南的特有種，僅分布在云南中甸高原，是典型的狹域分布種。中甸刺玫花大色艷，有香味，開花繁茂，是薔薇屬野生資源中的大花類型，具有極高的觀賞性，是十分珍貴的高山花卉資源，是高海拔地區(qū)園林綠化的樹種，也是月季雜交育種的重要親本材料，其果實(shí)富含營養(yǎng)。因此，中甸刺玫具有極高的保護(hù)和開發(fā)價(jià)值。該物種野生種群分布點(diǎn)有限且分散，生境脆弱，天然更新困難，亂挖亂采現(xiàn)象嚴(yán)重，分別被《中國物種紅色名錄》、《中國生物多樣性紅色名錄》列為易危物種和極危物種[1]。目前，對(duì)中甸刺玫的研究主要在種群分布特征[2]、引種馴化[3]、雜交起源[4]等方面，對(duì)其種子休眠和萌發(fā)方面的報(bào)道非常少。

瀕危植物的種子休眠特性是導(dǎo)致植株瀕危的一個(gè)重要原因[5]。海南龍血樹Dracaena cambodiana種子萌發(fā)對(duì)果皮、溫度、光照強(qiáng)度等微環(huán)境的依賴性較強(qiáng)，原有生境破壞導(dǎo)致種子萌發(fā)微環(huán)境的改變可能是其處于瀕危狀態(tài)的主要原因之一[6]。羽葉丁香Syringa pinnatifolia致瀕的內(nèi)部原因是其種子含有水溶性萌發(fā)抑制物，種群缺少實(shí)生幼苗[7]。珙桐Davidia involucrata、翅果油樹Elaeagnus mollis、裂葉沙參Adenophora lobophylla等瀕危植物的致瀕機(jī)制主要是其果實(shí)的特殊構(gòu)造或果實(shí)構(gòu)造在萌發(fā)中不占優(yōu)勢[8—13]。因此，在保護(hù)珍稀瀕危植物工作中，開展種子休眠和生態(tài)學(xué)特性研究有重要意義。

種子繁殖是被子植物最常規(guī)的繁殖方式之一。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中甸刺玫野外繁殖率低，居群內(nèi)存在根蘗苗和小幼苗，說明其繁殖大部分是通過根蘗苗的形式來完成，實(shí)生苗繁殖較少[4]。為較好地利用中甸刺玫這一珍稀瀕危植物，本文從種子結(jié)構(gòu)、種子內(nèi)抑制物活性等方面探索其休眠特性，探索中甸刺玫種子休眠的原因、類型及破解方法，從種子生物學(xué)角度了解中甸刺玫的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制及瀕危原因，為種群的保護(hù)、恢復(fù)和可持續(xù)利用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中甸刺玫種子采自香格里拉縣小中甸鎮(zhèn)(27.499°N，99.732°E)，該地區(qū)位于滇西地區(qū)橫斷山脈和滇中地區(qū)紅色高原交接處，是印度支那半島和青藏高原的轉(zhuǎn)折區(qū)域。主要受西南季風(fēng)和南支西風(fēng)急流的交替控制，形成寒溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫 5.8 ℃，最熱月平均氣溫 11.7～24.1℃，極端最低氣溫-19.4 ℃，年日照時(shí)數(shù)1742.9～2186.6 h，年均降雨量268～945 mm，無霜期129～197 d。

2011年10月中旬采集新鮮種子后，自然晾干，人工剝離肉質(zhì)果殼，放入瓶中室溫儲(chǔ)藏。研究中甸刺玫種子萌發(fā)抑制物選用白菜Brassica rapavar var. pekinensis種子，純度≥95%，凈度≥97%，發(fā)芽率≥82%，含水量≤8.0%。

采集香格里拉縣與中甸刺玫同一生長海拔(3300～4300 m)的薔薇科峨眉薔薇Rosa omeienisis種子，自然晾干，人工剝離果殼，放入瓶中室溫儲(chǔ)藏。峨眉薔薇生長于海拔750～4500 m，分布普遍，四川、湖北、陜西、寧夏、甘肅、青海、西藏地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，屬廣布種，適應(yīng)性強(qiáng)，抗病抗逆性強(qiáng)，故選用峨眉薔薇作為參照研究中甸刺玫種子形態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 瘦果、種子形態(tài)觀察 對(duì)10個(gè)樣地的中甸刺玫假果進(jìn)行取樣，每個(gè)樣地隨機(jī)取10個(gè)假果。在采摘一周后，對(duì)其瘦果重量、瘦果直徑、果實(shí)結(jié)籽率、種子直徑、千粒重等5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測量。用相同方法測量峨眉薔薇的果實(shí)和種子。

1.2.2 千粒重測定 參照《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB 2772-1999)相關(guān)規(guī)定，采用百粒重法測定種子千粒重，對(duì)10個(gè)樣地的種子進(jìn)行取樣，每個(gè)樣地隨機(jī)取100粒種子，并分別用1/1000天平稱取100粒種子的重量，測量后取平均值后乘以10。用相同方法測量峨眉薔薇。

1.2.3 種皮掃描電鏡觀察 將不經(jīng)任何處理的干燥種子的正面、立面和剝除胚的種殼粘于樣品臺(tái)上，經(jīng)噴金鍍膜，在掃描電鏡下觀察種子的種臍、外種皮、內(nèi)種皮等。置于KYKY-EM 3200掃描電鏡觀察并拍照，工作電壓25 kV。

1.2.4 種子吸水性 將干燥種子，濃硫酸處理3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h的種子，剝離種皮的種子分別放入蒸餾水中，每天用吸水紙吸干種子表面水分后稱重，直至恒重。每處理3次重復(fù)，取平均值。吸水率(%)=(Wx- W0)/ W0×100%。

1.2.5 果實(shí)結(jié)籽率 對(duì)10個(gè)樣地的假果進(jìn)行取樣，每個(gè)樣地隨機(jī)取10個(gè)假果，分別觀察種子數(shù)量，并記錄。用相同方法測量峨眉薔薇。結(jié)籽率=飽滿種子數(shù)/(空癟種子數(shù)+飽滿種子數(shù))。

1.2.6 赤霉素處理對(duì)胚的影響 采用不同濃度(100、500、1000 mg·kg-1)赤霉素處理胚，放置于20 ℃恒溫箱中，注意保持蛭石濕潤，定期觀察，以胚根伸長3 mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，分別記錄胚的萌發(fā)情況。

1.2.7 果殼、種皮、胚乳粗提物制備與活性測定

1.2.7.1 粗提物制備 隨機(jī)取種子 30粒，分離肉質(zhì)果皮、種皮、胚乳，然后將各部分分別用 80%甲醇研碎、浸提、過濾之后，仍用80%甲醇浸提殘?jiān)貜?fù)3次，合并濾液，減壓濃縮蒸干，用蒸餾水洗脫，定容至5 mL。

1.2.7.2 粗提物對(duì)白菜籽萌發(fā)的影響 用清水和不同濃度浸提液25 ℃下浸泡白菜種子2 h，然后每培養(yǎng)皿放入40粒種子，在25 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計(jì)白菜籽發(fā)芽率，重復(fù)3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 用Microsoft Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理間多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)與結(jié)籽率

中甸刺玫瘦果呈肉質(zhì)，黃綠色，瘦果平均重量82.53 g，平均直徑3.51 cm。種子表皮多數(shù)為淺褐色或褐色，少數(shù)呈黑色的種子不具胚或胚未發(fā)育完全。種子長7.54 mm，寬5.02 mm，厚3.96 mm。種子直徑為3.51 mm。

中甸刺玫的結(jié)籽率為0.69，顯著低于峨眉薔薇的結(jié)籽率(0.96)(表1) ，多數(shù)果實(shí)中沒有飽滿的種子。結(jié)籽率較低可能是導(dǎo)致中甸刺玫瀕危的原因之一。

2.2 千粒重

中甸刺玫種子的千粒重為86.37 g(表1)。然而10個(gè)樣方的種子千粒重在67.07～122.65 g之間，樣方間差異較大，這可能與各個(gè)樣方的土壤、光照等因子的差異有關(guān)。

表1 峨眉薔薇與中甸刺玫種子物理性狀特征值Table 1 Physical value of seeds of Rosa praelucens and R. omeienisis

2.3 種皮解剖結(jié)構(gòu)

2.3.1 種子各部分所占比例 中甸刺玫種子的外種皮重量占種子重量的21.38%，內(nèi)種皮占2.11%，胚占76.42%，胚乳占0.09%。

2.3.2 種皮結(jié)構(gòu) 中甸刺玫掃描電鏡觀察顯示，外種皮光滑且堅(jiān)硬，由排列緊密的多層厚壁細(xì)胞組成的排列緊密的表皮細(xì)胞(圖2: A)，再向內(nèi)為堅(jiān)硬致密的纖維狀的內(nèi)種皮，屬于明顯的柵欄組織，緊緊的包裹著胚(圖2: B)。中甸刺玫的種子極面觀為圓形(圖2: C)，赤道面觀為橢圓形，外壁表面有細(xì)網(wǎng)狀紋飾，并且有不規(guī)則突起，種臍比較明顯。

圖2 中甸刺玫種皮顯微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Seed coat microstructure of Rosa praelucens

2.4 種皮吸水性

圖3顯示，在25 ℃時(shí)，中甸刺玫未處理的種子吸水率較低，吸水量增加不明顯，13 d后增加量為18.82%。濃硫酸處理的種子吸水量迅速增加，且處理時(shí)間較長的種子吸水量快速增加。吸水24 h后去種皮處理和濃硫酸處理6 h的種子開始迅速吸水。至第3天后去種皮處理種子和濃硫酸處理6 h的種子吸水量基本保持不變，表明種子已經(jīng)飽和。由此可見，中甸刺玫的種皮透水性較差，對(duì)種子有效吸收水分的影響較大，是阻礙種子萌發(fā)的因素之一。

2.5 赤霉素處理對(duì)胚的影響

用不同濃度赤霉素處理中甸刺玫種胚，從胚的萌發(fā)率來看，各濃度處理間存在顯著差異。由表2可以看出當(dāng)赤霉素為100 mg·kg-1時(shí)，對(duì)胚培養(yǎng)的萌發(fā)起到最顯著的作用，萌發(fā)率為63.87%，說明100 mg·kg-1的赤霉素預(yù)處理可以加快胚的萌發(fā)速率。

2.6 種子萌發(fā)抑制物活性

用中甸刺玫種子各部分粗提液處理白菜種子，觀察其48 h后的萌發(fā)效果。結(jié)果表明，中甸刺玫粗提液對(duì)白菜種子萌發(fā)的抑制效果為：胚乳＞種皮＞果殼(表 3)。胚乳粗提液處理的白菜種子萌發(fā)率最低，種皮粗提液的抑制作用與果殼粗提液的抑制作用差異不顯著，但都顯著低于對(duì)照。說明中甸刺玫胚乳、種皮、果殼中存在萌發(fā)抑制物，與其種子休眠有關(guān)。

圖3 不同處理對(duì)種子吸水率的影響Fig. 3 Effect of factor on water permeation

表2 不同濃度赤霉素處理對(duì)胚的影響Table 2 Germination of embryo treated with GA3

表3 果實(shí)與種子提取液處理的白菜種子萌發(fā)率Table 3 Germination rate of Brassica rapavar var.pekinensis seeds treated with methanol extracts of Rosa praelucens fruits and seeds

3 討論

3.1 種子休眠類型

種子的休眠現(xiàn)象廣泛存在于植物當(dāng)中，Baskin等[16]將種子休眠劃分為5種類型，即生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和綜合休眠。在本研究中，種子吸水試驗(yàn)顯示，通過機(jī)械損傷預(yù)處理種子，在2 d內(nèi)能明顯提高種子的吸水率，可以達(dá)到種子萌發(fā)所需的含水量，完整種子在7 d內(nèi)仍然無法達(dá)到種子萌發(fā)所需含水量。通過電鏡觀察，中甸刺玫外種皮光滑且十分堅(jiān)硬，由多層排列緊密的厚壁細(xì)胞組成，內(nèi)種皮堅(jiān)硬致密，纖維狀，屬于明顯的柵欄組織，緊緊地包裹著胚。物理休眠是由種皮或者果皮中一層或者多層不透水的柵欄細(xì)胞所引起的。機(jī)械或者化學(xué)損傷可以解除物理休眠[6]。因此，種皮不透水性是導(dǎo)致中甸刺玫種子萌發(fā)困難的原因之一，可能屬于物理休眠和綜合休眠。

生理休眠是最普遍的休眠類型，廣泛存在于裸子植物和大多數(shù)被子植物的種子中[6]。中甸刺玫種皮、果殼、胚乳的甲醇粗提取液均對(duì)白菜籽萌發(fā)有明顯的抑制作用，說明存在抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物，抑制了中甸刺玫種子萌發(fā)。

中甸刺玫種子具有物理休眠和生理休眠的特征，屬于綜合休眠。種皮吸水性較差，100 mg·kg-1赤霉素預(yù)處理可以明顯提高胚的萌發(fā)率。

3.2 種子休眠的生態(tài)學(xué)意義

種子休眠是其對(duì)自然生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的一種方式[14]，對(duì)植物的生存、繁殖有著重要的意義[15—16]。中甸刺玫在適應(yīng)性進(jìn)化過程中形成的種子休眠與萌發(fā)有以下三點(diǎn)意義：其一，中甸刺玫僅生長于云南省香格里拉縣小中甸盆地碩多崗河流域內(nèi)，生長地幾乎為平緩的盆地及鄰近山麓，果實(shí)于9～10月成熟，此時(shí)為深秋，土壤水分少，對(duì)中甸刺玫的幼苗生長極為不利，種子以休眠的方式度過即將到來的寒冷冬季[4]。為適應(yīng)該環(huán)境，中甸刺玫種子在翌年春夏季溫度上升且雨水充沛時(shí)解除休眠萌發(fā)，為種群補(bǔ)充后代。其二，中甸刺玫果實(shí)成熟時(shí)已至深秋，為旱季，種子難以完成后熟過程；另外，中甸刺玫果實(shí)為豬喜食[4]，為適應(yīng)該情況，肉質(zhì)果表面有刺，種子形成堅(jiān)硬致密的內(nèi)外種皮保護(hù)胚和胚乳，其外種皮過于堅(jiān)硬導(dǎo)致胚難以充分吸水，這可能是中甸刺玫致瀕的重要原因。其三，中甸刺玫生長于高海拔環(huán)境，昆蟲多樣性和活動(dòng)能力降低，有性繁殖的幾率降低，而且種子萌發(fā)困難[5]，為適應(yīng)該環(huán)境，中甸刺玫主要是通過根孽苗方式進(jìn)行營養(yǎng)繁殖。

近年來，在中甸刺玫分布的小中甸區(qū)域，人口迅速增加，道路、房屋修建以及水電站等建設(shè)對(duì)其生境和種群造成了嚴(yán)重的影響。中甸刺玫雖然進(jìn)化出一系列適應(yīng)惡劣生境的對(duì)策，但由于分布狹窄、數(shù)量稀少，導(dǎo)致種群數(shù)量越來越少。種子萌發(fā)困難，種群缺乏實(shí)生苗，可能降低基因交流、物種進(jìn)化的幾率，增加物種淘汰的可能性。