曾文杰，肖自勇，金晨鐘，柏連陽，彭 瓊

(1.湖南人文科技學院農田雜草防控技術與應用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；2.湖南省農業(yè)科學院農業(yè)生物技術研究所，湖南 長沙 410125)

稗草Echinochloa spp.隸屬于禾本科稗屬，全球已發(fā)現(xiàn)約15種稗草，我國報道有8種。稗草一直是全球農業(yè)生產中的十大惡性雜草之一，嚴重威脅作物的產量和品質，其中在我國僅水稻危害面積就達670萬hm2，是中國水稻產區(qū)最主要的惡性雜草之一[1]。在過去的幾十年間，為克服稗草對作物安全生產的危害，農田化學防治已成為全球現(xiàn)代農業(yè)生產的重要手段之一。然而，由于化學除草劑的過度依賴和長期衍變，雜草抗藥性問題日益突出，倍受全球關注[2]。

二氯喹啉酸屬于合成激素類除草劑，是控制水稻田稗草生長的優(yōu)秀除草劑之一，尤其對高齡稗草有特效[3]。自1995年二氯喹啉酸在湖南省洞庭湖與東江湖流域直播稻區(qū)大面積推廣應用以來，其使用年限達二十年以上。許多地區(qū)已經形成抗二氯喹啉酸的稗草種群，且部分地區(qū)抗性稗草對二氯喹啉酸的抗藥性指數(shù)達 600倍以上[4]。抗性稗草種群在我國稻區(qū)的蔓延擴大，不僅直接影響水稻的產量與品質，而且間接傳播水稻重要病蟲害，嚴重威脅水稻安全生產與農田生態(tài)環(huán)境。

生長素(IAA)是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，主要在植物體中具有分生能力的莖尖、幼葉和根等組織器官中合成，在調節(jié)植物從胚胎發(fā)生到成熟的生長進程中起著決定性作用[5]。生長素信號轉導途徑中的GH3參與稗草對二氯喹啉酸產生抗藥性的過程[6]。目前，稗草對二氯喹啉酸產生抗性的機理研究主要集中在兩種假說。一種認為稗草1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(EcACO)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(EcACS)活性下降，短時間內無法積累足夠的乙烯和有毒物質氰化物[7—9]。在植株體內產生乙烯和氰化物的過程經過了生長素信號通路[10—12]；然而，生長素及其代謝途徑中的相關基因在稗草對除草劑產生高抗性過程中的作用機制尚不清楚。另一種則認為稗草對二氯喹啉酸產生抗性與β-氰丙氨酸合成酶(β-CAS)活性增強有關，抗性稗草主要通過提高氰化物解毒酶β-CAS的活性，從而控制有毒氰化物產生[13]。

本課題組以篩選得到的遺傳背景一致的二氯喹啉酸敏感型生物型(S)稗草及抗性生物型(R)稗草為材料進行研究，發(fā)現(xiàn)敏感型與抗性型稗草之間無論是在14C-二氯喹啉酸的吸收、運轉、代謝水平上，還是乙烯代謝途徑中EcACO、EcACS的基因表達水平，亦或是β-CAS酶活及其基因表達水平上均無顯著差異(待發(fā)表)。本文通過外施二氯喹啉酸、生長素處理，研究稗草對二氯喹啉酸產生抗性過程中的生長發(fā)育及其生長素含量變化，明確外源生長素處理對敏感和抗性兩種生物型稗草材料產生的生態(tài)適合度差異，為下一步充分利用稗草基因組數(shù)據(jù)解析抗藥性產生的機理奠定基礎，以期為稗草綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為不同生物型稗草：二氯喹啉酸敏感型(S)、抗性型(R)，均采集于湖南省常德市鼎城區(qū)水稻田?？剐园薏輰Χ揉酖R50(抑制稗草干物質重50%所需藥劑劑量)抗性倍數(shù)＞78。試劑為75%二氯喹啉酸(美國Nufarm公司)，IAA(Sigma，純度大于98.0%)。

1.2 方法

選取飽滿的稗草種子，用98%濃硫酸浸泡處理4 min后，充分清洗干凈。然后將預處理后的稗草種子鋪在0.7%瓊脂板上，做好標記。待稗草種子發(fā)芽長至2～3 cm時定植于花盆(21.5×21.5×45.0 cm)，每盆移栽15株，培養(yǎng)基質為過篩稻田土∶營養(yǎng)土=2∶1(V/V)。

待稗草長至3葉期，利用3WP-2000型行走式噴霧塔TP6501E噴頭進行藥劑處理，每處理設3次重復。試驗設計如下：①以800 g·hm-2(田間推薦劑量)二氯喹啉酸進行莖葉處理(Q)；②0.1 mmol·L-1IAA溶液噴施處理30 min后，再進行800 g·hm-2二氯喹啉酸的莖葉處理(Q+IAA)。以未進行藥劑處理、正常生長的稗草材料為對照(CK)。于處理后24 h取樣，測定植株高度(植株基部與最長葉片葉尖之間的距離)、單株重量。蛋白濃度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性采用南京建成生物工程研究所生產的測試盒測定。

生長素含量(IAA)測定采用高效液相色譜法(HPLC法)；生長素的提取參照Peng等[14]的方法，并進行改進。準確稱量植物樣品0.2000 g，液氮速凍后研磨成粉；加入1 mL 80%甲醇后充分混勻，于4 ℃冰箱中浸提過夜；次日12 000 g冷凍離心10 min，將上清液移至1.5 mL離心管中；殘渣用0.8 mL 80%甲醇重復浸提2次，每次浸提4 h，離心后合并3次上清液，冷凍濃縮至干；200 μL 0.1 mol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.8)復溶樣品，超聲波振蕩至完全溶解；200 μL石油醚萃取，充分混勻，棄去上層醚相，保留下層水相，重復1次，至上層清澈無色為止；水相過自制的過濾柱，去除殘渣，200 μL超純水重復洗滌過濾柱2次；C18柱中先加入1.0 mL 100%甲醇，待流干后重復1次，而后加入300 μL超純水，進行C18柱的預平衡；植物樣本濾液經過預平衡后的C18柱，300 μL超純水洗脫后，1.2 mL 80%甲醇洗脫并收集，冷凍濃縮至干，用于HPLC的分析。高效液相色譜法條件為：Waters C18分析柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，RF-10AXL熒光檢測器；流動相用35%甲醇和65%的0.1%甲酸溶液，流速1 mL·min-1，檢測波長218 nm，柱溫35 ℃；進樣量20 μL，根據(jù)外標法定量。

數(shù)據(jù)作圖采用Microsoft Excel 2010，用SPSS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 二氯喹啉酸對稗草生長特性的影響

由表1可知，敏感型(S)和抗性型(R)稗草的植株高度及單株重量在苗期具有一定差異。在不施藥情況下，R型植株高度及單株重量分別比S型高45.5%和28.1%。二氯喹啉酸單獨處理24 h后，R型植株高度及單株重量分別比S型高54.6%和84.2%。二氯喹啉酸與IAA共同處理后，與S型相比，R型植株高度及單株重量分別提高68.3%和125%。

二氯喹啉酸和IAA處理24 h后，敏感型稗草(S)的植株高度及單株重量與對照無顯著差異；抗性型稗草(R)的植株高度在二氯喹啉酸和IAA處理24 h后，與對照相比也無顯著差異；二氯喹啉酸單獨處理、二氯喹啉酸與IAA共同處理后，R型稗草單株重量都顯著高于對照，分別比對照高70.7%和75.6%。

表1 二氯喹啉酸對稗草幼苗生長的影響Table 1 Effect of quinclorac on seeding growth of barnyardgrass

2.2 二氯喹啉酸對稗草蛋白濃度的影響

二氯喹啉酸處理下，S型和 R型稗草幼苗中蛋白濃度與對照差異不顯著，蛋白濃度分別增加了24.8%和31.3%。在加入外源IAA的二氯喹啉酸處理下，與二氯喹啉酸單獨處理相比，S型稗草的蛋白濃度顯著降低了24.9%，R型稗草中的蛋白濃度無顯著變化；與對照相比，S型和R型稗草中的蛋白濃度均無顯著差異。在不施藥、二氯喹啉酸單獨處理、二氯喹啉酸與IAA共同處理的條件下，R型稗草蛋白濃度都比S型稗草高，分別高23.5%、29.8%和64.0%(圖1)。

2.3 二氯喹啉酸對POD活性的影響

由圖2所知，在兩種不同施藥處理下，S型和R型稗草體內POD活性與對照均無顯著差異。二氯喹啉酸處理后，與對照相比，S型和R型稗草POD活性分別降低23.9%和25.0%；在二氯喹啉酸與IAA共同處理下，與對照相比，S型稗草POD活性提高8.2%，而R型稗草POD活性反而降低20.7%。

圖1 二氯喹啉酸對稗草蛋白濃度的影響Fig. 1 Effect of quinclorac on protein concentration of barnyardgrass

圖2 二氯喹啉酸對稗草POD活性的影響Fig. 2 Effect of quinclorac on POD activity of barnyardgrass

2.4 二氯喹啉酸對SOD活性的影響

兩種生物型稗草SOD活性測定表明(圖3)，R型稗草在兩種二氯喹啉酸處理條件下與對照相比均無顯著差異。S型稗草SOD活性在二氯喹啉酸單獨處理24 h后比對照顯著提高29.6%；在二氯喹啉酸與IAA共同處理后SOD活性僅增加3.5%，與對照無顯著差異。與二氯喹啉酸單獨處理相比，外施IAA的二氯喹啉酸處理下，S型稗草SOD活性降低20.2%，而R型稗草中SOD活性提高2.0%。

2.5 二氯喹啉酸對稗草生長素含量的影響

S型稗草體內生長素含量在兩種施藥處理下與對照相比均無顯著變化，而R型稗草體內的生長素含量在各個處理之間變化顯著(圖 4)。與對照相比，二氯喹啉酸處理下，S型稗草中 IAA含量僅提高25.6%，而R型稗草中IAA含量顯著增加3倍左右。與二氯喹啉酸單獨處理相比，在二氯喹啉酸與IAA共同處理下，S型稗草的IAA含量降低40.5%，而R型稗草IAA含量顯著提高109.1%。與對照相比，在二氯喹啉酸與IAA共同處理下，S型稗草的IAA含量降低25.3%，而R型稗草的IAA含量顯著增加7倍左右。

圖3 二氯喹啉酸對稗草SOD活性的影響Fig. 3 Effect of quinclorac on SOD activity of barnyardgrass

圖4 二氯喹啉酸對稗草體內生長素的影響Fig. 4 Effect of quinclorac on auxin in barnyardgrass

3 討論

二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效選擇性除草劑。二氯喹啉酸處理后會抑制植物生長，導致植株幼嫩組織黃化，逐步失綠，最終死亡[11]。本研究的實驗材料為課題組前期利用單株分蘗法篩選的遺傳背景一致的不同生物型(S型和R型)稗草。材料均通過兩代繁種、收種。在不施藥情況下，抗性型稗草植株高度及單株重量在苗期均高于敏感型稗草(表1)。

目前，雜草抗藥性機理的研究主要集中在非靶標位點抗性(non-target-site resistance, NTSR)和靶標位點抗性(target-site resistance, TSR)[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，敏感型與抗性型稗草在14C-二氯喹啉酸的吸收、運轉、代謝水平上并無顯著差異。因此，稗草抗二氯喹啉酸的主要原因可能是生長素代謝通路中某一靶標位點的突變。同時，本課題組在14C-二氯喹啉酸的代謝研究中發(fā)現(xiàn)，S型和R型稗草在處理后的較短時間內就能很快代謝二氯喹啉酸，且S型和R型稗草在代謝水平上無顯著差異(待發(fā)表)。因此，本研究選擇二氯喹啉酸處理24 h后進行取樣及相關測定。無論是二氯喹啉酸單獨處理，還是與IAA共同處理，R型稗草的單株重量與對照相比分別提高70.7%和73.2%，這是R型稗草對二氯喹啉酸具有高抗藥性的生理基礎。二氯喹啉酸處理后，S型稗草的植株高度及單株重量與對照相比并未顯著降低，這說明800 g·hm-2二氯喹啉酸處理24 h并未對S型稗草的生長產生明顯的抑制作用。相反，二氯喹啉酸單獨處理及外施 IAA的二氯喹啉酸處理均能顯著促進 R型稗草的平均鮮重。前期研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol·L-1IAA溶液噴施處理并不影響3葉期稗草植株的生長發(fā)育(待發(fā)表)。與二氯喹啉酸單獨處理相比，外施IAA的二氯喹啉酸處理下，S型和R型稗草的植株高度有所下降，可能是外源生長素IAA被植株吸收后影響植株體內的生長素信號通路，從而抑制稗草植株的生長。

可溶性蛋白的親水膠體性質強，能明顯增強細胞的持水力。可溶性蛋白質的增加可以束縛更多的水分，同時減小逆境對植物產生的危害[16]。植物體內可溶性蛋白是一種很好的滲透調節(jié)物質，其含量可以反映植物對非生物脅迫的耐受能力[17]。本研究表明，抗性生物型稗草的蛋白濃度高于敏感性生物型稗草(圖1)，體現(xiàn)了R型稗草對非生物脅迫的高耐受能力。與二氯喹啉酸單獨處理相比，加入外源生長素IAA的二氯喹啉酸處理后，S型和R型稗草的蛋白濃度均有所下降，S型稗草顯著降低24.9%，R型稗草僅降低5.1%，說明加入外源IAA后，在二氯喹啉酸的影響下，S型稗草的蛋白質合成受到抑制，S型稗草植株承受了較大的逆境危害。

當遭受脅迫時，植物體內產生活性氧(ROS)從而影響植物生長發(fā)育，相應的植株體內也有一套活性氧清除系統(tǒng)來保護植物免受危害，POD和SOD是植物體內防御活性氧毒害的重要保護酶系[18—19]。本研究表明，在二氯喹啉酸單獨處理及外加IAA的二氯喹啉酸處理下，S型與R型稗草植株中POD活性與對照相比均無顯著差異(圖2)，說明經過二氯喹啉酸處理后植株本身防御酶系統(tǒng)的POD未發(fā)揮主要的保護作用。與對照相比，R型稗草SOD活性變化較小，說明其清除自由基的能力較強；S型稗草中的SOD活性顯著提高了29.6%(圖3)，表明S型稗草受到的活性氧傷害大，因而提高了自身的SOD活性[20]，而在施入外源IAA后，S型稗草POD活性與對照和單獨二氯喹啉酸處理相比升高了，說明IAA能夠通過提高敏感性稗草POD活性來抵御脅迫；R型稗草SOD、POD活性與其他處理相比變化幅度較小，說明IAA對抗性稗草的SOD、POD活性影響較小。

生長素能夠促進植株生長發(fā)育及細胞分裂，同時還能夠提高植物抗逆境脅迫的能力[21]。植物在受到逆境脅迫時，其體內的激素含量會發(fā)生變化，生長素作為植物激素，必然與逆境脅迫有著聯(lián)系[22]。本研究中，在不施藥、二氯喹啉酸單獨處理、二氯喹啉酸與IAA共同處理的條件下，S型稗草體內的生長素含量變化幅度較小。與對照相比，R型稗草在二氯喹啉酸單獨處理下生長素顯著增加3倍，在二氯喹啉酸與IAA共同處理下生長素顯著增加7倍，說明IAA含量增加對高抗二氯喹啉酸稗草的生長具有一定的促進作用。