陳彥潔，柳傳毅，呂滿霞，方瓊彤，吳新榮*

1華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510641；2中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部；3廣州市老年慢病患者合理用藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510010

體癬是最為常見的皮膚淺部真菌病，是除了頭部、手部、腳部和甲部外，發(fā)生在身體皮膚上的皮膚真菌感染。目前，約有40個不同種類的的皮膚癬菌，而根據(jù)其消化角質(zhì)能力的不同分為三大屬：毛癬菌屬(Trichophyton)、小孢子菌屬(Microsporum)和表皮菌屬(Epidermophyton)[1,2]。隨著廣譜抗生素的長期使用，真菌耐藥菌株的出現(xiàn)，開發(fā)天然無副作用的抗菌藥物有著重要的意義。蒺藜為蒺藜科蒺藜屬植物蒺藜(TribulustermtrisL.)的干燥成熟果[3]。甾體皂苷(Steroidalsaponins)為蒺藜的主要成分之一，現(xiàn)代研究表明，蒺藜皂苷類具有抗衰老、抗菌、抗癌等作用[4]。甾體皂苷通常都為很好的抗菌物質(zhì)[5]，甾體皂苷TTS-12是從蒺藜全草中分離純化得到的單體產(chǎn)物，屬于螺甾烷醇型甾體皂苷，其化學(xué)名為替告皂苷元3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-[β-D-吡哺木糖(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷[6]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。前期研究表明，甾體皂苷TTS-12對常見的四種皮膚癬菌，紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)、須癬毛癬菌(T.mentagrophytes)、石膏樣小孢子菌(Microsporumgypseum)和犬小孢子菌(Microsporumcanis)均有較強(qiáng)的抗菌活性[7]。體外抗皮膚癬菌的效果決定了TTS-12是否具有成藥的潛質(zhì)，除了用CLSI的M38-A2方案對皮膚癬菌進(jìn)行最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的檢測外[8]，本實(shí)驗(yàn)還選了多種指標(biāo)考察TTS-12對皮膚癬菌的抑菌作用，以此來充分證明TTS-12的抗皮膚癬菌效果。隨后采用自制的蒺藜TTS-12凝膠劑觀察其對感染須癬毛癬菌的豚鼠體癬治療效果，進(jìn)一步研究在動物水平上，蒺藜TTS-12的抗菌效果，為蒺藜TTS-12開發(fā)成新的抗真菌藥物提供科學(xué)理論依據(jù)。

圖1 蒺藜TTS-12化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds TTS-12

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

LRH-70生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、BHC-IIB2生物安全柜(廣州蘇凈醫(yī)療設(shè)備有限公司)、YXQ-LS-18SI壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、OLYMPUS生物顯微鏡(奧利巴斯有限公司)、BP210S型電子天平(德國賽多利斯) LRH-70生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-IF凈化工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；移液槍(美國Thermo公司)。

1.2 材料

TTS-12對照品(純度：99.6%)由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室提供、酮康唑(純度>98.0%，MACKLIN)；氟康唑(純度>98.0%，aladdin)；酵母粉(OXOID，批號：1338303-02)、YEAST EXTRACT(OXOID)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3104890)、RPMI-1640 Medium(SIGMA公司)；二甲基亞砜分析純(天津大茂化學(xué)試劑廠)；3799-96孔板(COSTAR)；自制0.5%、0.8%、1%蒺藜TTS-12凝膠；鹽酸特比萘芬乳膏(中美天津史克制藥有限公司，批號：L07060A)；脫毛膏(薇婷，批號：20150321)。

1.3 菌株和動物

須癬毛癬菌[Trichophytonmentagrophyton,CMCC(F)T5e]、近平滑菌念珠菌(Candidaparapsilosis，ATCC22019)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，21株須癬毛癬菌臨床分離菌株由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈；普通級豚鼠，每只體重約200～250 g，雌雄各半，共56只。試驗(yàn)動物許可證號：SCXK(粵)2016-0002，NO.44007200002096。于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物中心普通環(huán)境飼養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 真菌的培養(yǎng)及菌液的配置

須癬毛癬菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃的培養(yǎng)箱中活化7～14天。選取生長狀態(tài)良好，無污染的菌落作為受試菌株，于菌落上滴加適量0.85%無菌生理鹽水，用無菌棉棒輕輕反復(fù)刮擦菌落表面，使孢子充分與生理鹽水充分混合。用兩層紗布過濾菌懸液至離心管中，再放置于渦旋振蕩器震蕩15 s左右。用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至2～6×105CFU，最后用不含氮源RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋10倍，備用。

2.2 TTS-12對皮膚癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床菌株最小抑菌濃度(MIC)

采用CLSI M38-2方案對MIC，MIC的測定方法如下：將適量TTS-12溶于DMSO中，使?jié)舛葹?.4 mg/mL，吹打均勻后用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋100倍。取96孔板，1～10孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，將100 μL藥液培養(yǎng)基加至第10孔中，用移液槍吹打均勻后轉(zhuǎn)移10 μL至第9孔，以此類推直至第1孔，舍棄最后100 μL。TTS-12的濃度范圍在0.062 5～32 μg/mL。1～10孔加入100 μL菌液。第11孔加入200 μL無菌培養(yǎng)基作為空白對照，第12個孔加入100 μL無菌培養(yǎng)基和100 μL菌液作為陰性對照。每組平行3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4天后判讀結(jié)果，無菌生長孔所對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。

2.3 TTS-12對皮膚癬菌標(biāo)株及臨床菌株的最小殺菌濃度(MFC)

從以上的藥敏板中轉(zhuǎn)移完全抑制真菌生長的攜藥培養(yǎng)基至PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5天，肉眼觀察有無真菌生長，無真菌生長菌液所對應(yīng)的的最小濃度為MFC。質(zhì)控實(shí)驗(yàn)在與上述實(shí)驗(yàn)平行操作的條件下進(jìn)行，近平滑念珠菌(ATCC 22019)作為質(zhì)控菌株，酮康唑作為質(zhì)控藥，按照以上的步驟步驟對質(zhì)控菌株進(jìn)行MIC測定，當(dāng)MIC落在0.062 5～0.5 μg/mL時數(shù)據(jù)可信有效。

2.4 TTS-12對菌絲生長的抑制作用

配制TTS-12濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的PDA平板培養(yǎng)基。用0.7 cm打孔器取生長良好的菌塊作為菌餅，接種于載藥培養(yǎng)基上，于28 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)15天，每24 h觀察一次，平行5次。

菌落直徑(cm)=測量菌落直徑﹣0.7

菌絲生長抑制率=[(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/ 對照組菌落直徑]×100%

2.5 TTS-12對孢子萌發(fā)動力學(xué)的影響

TTS-12用DMSO溶解后，再用100倍生理鹽水溶解，使終濃度為1、2、4、8 μg/mL。接種10 μL 1～4×108spores/mL菌液，斡旋震蕩后，分別置于室溫處理30、60、90、120、150、180 min，10 000 rpm離心5 min，用無菌生理鹽水沖洗孢子，重懸于100 μL無菌水中，取10 μL置于含PDA的凹玻片中，置于濕盒中于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，平行5次。

孢子萌發(fā)率=(發(fā)芽孢子數(shù)/孢子總數(shù))×100%

2.6 豚鼠體癬模型制備

取豚鼠56只，每只豚鼠后背部用剃毛刀剃毛(2.5 cm×2.5 cm)，然后輕涂適量脫毛膏，5 min后用滅菌水清理干凈背部的毛并擦干，用手術(shù)刀刮傷皮膚至有針狀血出現(xiàn)為止，隨機(jī)取8只(雌雄各半)作為空白組，其余48只豚鼠用制備好的菌懸液(濃度調(diào)節(jié)為1×107CFU/mL)涂抹于創(chuàng)面上0.4 mL/d，空白組用無菌生理鹽水涂抹于創(chuàng)面上0.4 mL/d，每天觀察并且重復(fù)染菌至第5天，取背部接種處皮屑用 10% 氫氧化鉀進(jìn)行鏡檢，以鏡檢陽性為造模成功。

2.7 分組給藥及評價方法

成功造模后，將豚鼠隨機(jī)分為模型組、陰性對照組、陽性對照組及低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只?？瞻捉M、模型組給予無菌生理鹽水，陰性對照組給予空白凝膠基質(zhì)、陽性對照組給予鹽酸特比萘芬乳膏、低中高劑量組組分別給予0.5%、0.8%、1%的蒺藜TTS-12凝膠。48小時內(nèi)開始給藥，每只豚鼠背部給于0.4 mL/天，每天一次，連續(xù)給藥7天。開始給藥后每天觀察并對背部病變程度進(jìn)行評分[9]，具體評分見表1。

表1 豚鼠背部病變程度評分標(biāo)準(zhǔn)

給藥7天后，第8天將豚鼠處死，用無菌生理鹽水清洗背部皮膚，取病灶部位皮膚，每只豚鼠病灶皮膚處取5塊5×5 mm組織，2塊皮膚放置于10%甲醛溶液中，做HE染色切片，用顯微鏡觀察病灶皮膚炎性發(fā)生情況。剩余3塊放入70%乙醇中浸泡2～3 min，殺滅雜菌，經(jīng)無菌生理鹽水清洗后接種到含青霉素和放線菌酮的PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，7天后觀察須癬毛癬菌生長情況，計算病灶皮膚真菌培養(yǎng)的陰性率。

2.8 統(tǒng)計方法及數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用軟件SPSS20.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組豚鼠背部病變程度評分比較采用單因素方差分析，各組病灶皮膚真菌培養(yǎng)陰性率比較采用χ2檢驗(yàn)，設(shè)P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定

用肉眼觀察，與生長對照組孔相比，約抑制80%真菌生長的孔所對應(yīng)的的最低濃度為最小抑菌濃度。TTS-12對須癬毛癬菌及其臨床菌株均有較好的抑菌活性，對須癬毛癬菌的MIC值為1 μg/mL，對兩者種的臨床菌株MIC范圍為1～8 μg/mL和0.5～8 μg/mL。其抑菌活性高于抗真菌常用藥物氟康唑，與酮康唑相似。實(shí)驗(yàn)中質(zhì)控菌株的MIC落在有效范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)可信有效(表2，3)。

表2 TTS-12及3種藥物對21株須癬毛癬菌臨床菌株的MIC(μg/mL)

表3 TTS-12及3種藥物對21株須癬毛癬菌臨床菌株的MIC(μg/mL)

3.2 最小殺菌濃度(MFC)的測定

TTS-12對須癬毛癬菌的MFC為8 μg/mL，對臨床菌株的的MFC在4～32 μg/mL。結(jié)果表明，TTS-12對須癬毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株均有較好的殺菌作用(表4，5)。

3.3 TTS-12對菌絲生長的抑制作用

TTS-12對皮膚癬菌的菌絲抑制程度隨濃度遞增，如圖2所示，在第15天時，濃度4 μg/mL的TTS-12對須癬毛癬菌的菌絲生長抑制率已經(jīng)高于60%，蒺藜TTS-12對須癬毛癬菌菌絲生長有良好的抑制效果。

表4蒺藜TTS-12及常用藥物對須癬毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MFC值(μg/mL)

Table 4 MFC of TTS-12 and common antifungal drug against two standard strains ofT.mentagrophytes(μg/mL)

藥物Drugs須癬毛癬菌T.mentagrophytesTTS-128氟康唑Fluconazole64酮康唑Ketoconazole8鹽酸特比萘芬Terbinafine hydrochloride0.25

表5 TTS-12及3種藥物對21株須癬毛癬菌臨床菌株的MFC(μg/mL)

3.4 TTS-12對孢子萌發(fā)動力學(xué)的影響

TTS-12 對須癬毛癬菌的孢子萌發(fā)動力學(xué)如圖3所示，用不同濃度的TTS-12(1～8 μg/mL)處理須癬毛癬菌，其可以抑制皮膚癬菌的孢子萌發(fā)，其抑制孢子萌發(fā)的效果與TTS-12的濃度和時間呈正相關(guān)。

3.5 豚鼠背部病變程度評分

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在接種菌液的第5天后，各組均出現(xiàn)有紅斑及白色或淡黃色的鱗屑，并伴有出血的病變情況，在給藥的期間，除了模型組和陰性對照組外，其余各組均顯著降低豚鼠背部病變程度評分，對背部體癬癥狀有一定的改善，紅斑減少，厚皮脫落皮膚變光滑，各組一般背部病變情況可見圖4。給藥第1天，和空白對照組比較，模型組及各給藥組豚鼠背部病變程度評分顯著增加且皮屑鏡檢為陽性，表明造模成功并且各給藥組評分無差異說明各組豚鼠分配均勻；和模型組相比，給藥的第1、4、8天，陰性對照組豚鼠背部病變程度評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明陰性對照組的空白凝膠劑基質(zhì)對體癬模型背部病變情況沒有明顯改善。給藥第4天，和模型組相比，低劑量組能降低豚鼠背部病變程度評分并具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，中劑量組、高劑量組能顯著性降低豚鼠背部病變程度評分(P<0.01)，陽性對照組未見顯著降低豚鼠背部病變程度評分，在給藥第8天中劑量組、高劑量組與陽性對照組相比效果相當(dāng)，沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖5)。

圖2 不同濃度的TTS-12分別對須癬毛癬菌絲生長的影響(n=5，x±s)Fig.2 Effect of different concentrations of TTS-12 for T.mentagrophytes(n=5，x±s)

圖3 TTS-12對須癬毛癬菌的孢子萌發(fā)動力學(xué)影響(n=5，x±s)Fig.3 Effect of kinetics of T.mentagrophytes spores by TTS-12(n=5，x±s)

3.6 豚鼠病灶皮膚病理變化

病灶皮膚HE染色切片結(jié)果表明，模型組和陰性對照組病灶真皮層中可以見到有大量的中性粒細(xì)胞浸潤，棘層肥厚，有明顯的炎性，角質(zhì)層可見有菌絲，低中高劑量組有一定程度的棘層肥厚，但厚度小于模型組，炎性細(xì)胞浸潤較模型組輕，但比陽性對照組嚴(yán)重，其中高劑量組的角質(zhì)層正常，炎癥情況比較輕。各組HE染色病理結(jié)果見圖6。

3.7 豚鼠病灶皮膚真菌培養(yǎng)陰性率

造模成功后，病灶背部皮膚皮屑鏡檢下可以觀察到有大量的菌絲，給藥處理后取病灶皮膚進(jìn)行真菌培養(yǎng)，其陰性率能一定程度反映藥物的殺菌效果。病灶皮膚真菌培養(yǎng)結(jié)果顯示各組真菌培養(yǎng)陰性率分別為：空白組100%、模型組20.83%、陰性對照組25%、陽性對照組75%、低劑量組41.67%、中劑量組54.17%、高劑量組66.67%，其中空白組背部皮膚的真菌培養(yǎng)未見有須癬毛癬菌的生長，模型組大多數(shù)病灶皮膚的真菌培養(yǎng)可見有須癬毛癬菌的生長。結(jié)果表明，與模型組相比，中劑量組皮膚真菌培養(yǎng)陰性率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，陽性對照組、高劑量組皮膚真菌培養(yǎng)陰性率有明顯的差異(P<0.01)，且兩者皮膚真菌培養(yǎng)陰性率相當(dāng)，說明高劑量組表現(xiàn)出一個比較好的殺菌作用，具體結(jié)果見表6。

圖4 各組豚鼠背部病變情況(n=10)Fig.4 Groups of guinea pig lesions(n=10)注：A模型組，B陰性對照組，C低劑量組，D中劑量組，E高劑量組，F(xiàn)陽性對照組。Note:A:Model group,B:Negative group,C:Low-dose group,D:Middle-dose group,E:High-dose group,F:Positive group.

圖5 給藥后各組豚鼠背部癥狀評分圖(n=10,x±s)Fig.5 Lesion score of guinea pig after treatment(n=10,x±s)注：與模型組相比，*表示P<0.05，** P<0.01。Note:Compare with control,*P < 0.05;** P < 0.01.

4 討論

蒺藜被分離鑒定出含有載體皂苷、黃酮、糖苷、植物甾醇、單寧酸等化合物。皂苷和黃酮作為蒺藜中的主要代謝產(chǎn)物，因其具有多種生物活性，成為蒺藜研究的主要對象。學(xué)者發(fā)現(xiàn)其甾體皂苷種類豐富，多達(dá)108種[10]，蒺藜TTS作為一種螺甾烷醇型甾體皂苷具有良好的抗菌活性。

隨著越來越多的研究從中藥或植物中尋找有效抗真菌成分，這些新型抗真菌成分藥效的評價和檢測方法也隨之發(fā)展和系統(tǒng)化。對活性成分進(jìn)行體外抗真菌和毒性評價是篩選的第一步，隨后進(jìn)行體內(nèi)動物模型試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 各組HE染色病理切片(×400)Fig.6 HE pathological section(×400)注：A空白組，B模型組，C陰性對照組，D陽性對照組，E低劑量組，F(xiàn)中劑量組，G高劑量組。Note:A:Blank group,B:Model group,C:Negative group,D:Positive group,E:Low-dose group,F:Middle-dose group,G:High-dose group.

表6 病灶皮膚真菌培養(yǎng)陰性率

注：與模型組相比，*表示P<0.05；**P<0.01；與陽性對照組相比，#表示P<0.05。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with positive,#P<0.05.

在標(biāo)準(zhǔn)化的體外抗菌藥敏實(shí)驗(yàn)方案中，美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLinical and Standards Institute，CLSI)制定的M27-A3、M38-A2就為我們提供了一個快速、簡單、可靠的測量方法，方案提出后眾多學(xué)者都采取此方法進(jìn)行抗菌藥物篩選[11]。體外實(shí)驗(yàn)中測得TTS-12對須癬毛癬菌的標(biāo)株菌株的MIC≤4 μg/mL，MFC≤32 μg/mL，且TTS-12能夠顯著抑制須癬毛癬菌的菌絲生長，孢子萌發(fā)，說明蒺藜TTS-12有較強(qiáng)的體外抗菌活性。本次實(shí)驗(yàn)中同時選取了標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株測定其抗菌作用，使數(shù)據(jù)具有一定的代表性和可信服性。

而對于動物感染體癬模型的研究從很早就已見報道，最早可見1908年Bloch建立體癬動物模型的報道，隨后越來越多的學(xué)者對動物體癬模型進(jìn)行探討，包括對動物的選擇，感染菌株的選擇，預(yù)處理和處理方法的比較及接種范圍等[12]。動物體癬模型的造模在感染菌株的選取上，可選用紅色毛癬菌、須癬毛癬菌或犬小孢子菌，但由于犬小孢子菌產(chǎn)孢較少，菌懸液濃度達(dá)不到高濃度，紅色毛癬菌為親人性菌株，它在自然環(huán)境下極少感染動物，因此需要使用免疫抑制劑干預(yù)才能造模成功，須癬毛癬菌同時具有親人和親動物的特點(diǎn)，使其成為造模更理想的選擇。

此外，豚鼠感染皮膚癬菌病理進(jìn)程也是可預(yù)測的：豚鼠在接種菌株之后的4到6天會有短暫的紅斑或丘疹出現(xiàn)，并在7到8天之間反應(yīng)達(dá)到高峰期，隨后紅斑或丘疹就會逐漸增加并融合在一起。在接種的4周內(nèi)，這些病變情況逐漸發(fā)生后，大多數(shù)豚鼠會自愈，所以試驗(yàn)中建議在豚鼠感染后3～5天給藥，觀察時間控制在2周內(nèi)[13]。

本試驗(yàn)從豚鼠背部病變程度評分、病灶皮膚真菌培養(yǎng)陰性率及病灶皮膚病理變化來綜合評價低中高劑量的蒺藜TTS-12凝膠對豚鼠感染須癬毛癬菌體癬模型的作用，從試驗(yàn)結(jié)果來看，相對于模型組，低中高劑量的蒺藜TTS-12凝膠對于病灶皮膚出現(xiàn)的紅斑、出血、瘙癢有一定程度的緩解作用，能不同程度地殺滅侵襲皮膚的須癬毛癬菌，并呈一定的量效關(guān)系，其中高劑量組的治療效果最佳，與陽性對照組相當(dāng)，以上研究為蒺藜TTS-12凝膠以后臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。