班篤敬,魏 煒,申 超,繆雪華,劉文生*
1南京中醫(yī)藥大學(xué),南京210023;2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科,南京 210014
酒精性脂肪肝病(alcohol fatty liver disease,AFLD)是因長期大量攝入酒精導(dǎo)致的以肝細胞脂肪變性為主要表現(xiàn)的肝損害性疾病,若疾病持續(xù)進展,則會導(dǎo)致酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化,引起肝細胞壞死甚至肝功能衰竭[1]。近年來酒精性脂肪肝在我國的發(fā)病率有所升高,酒精已成為導(dǎo)致肝臟損傷的第二大因素。長期大量攝入酒精,可干擾脂肪氧化,同時促進脂肪生成,引發(fā)脂質(zhì)代謝異常,脂肪在肝細胞內(nèi)蓄積后引起肝細胞受損[2]。目前,酒精性脂肪肝的臨床藥物治療研究鮮有突破。
木香烴內(nèi)酯(costunolide)是一倍半萜內(nèi)酯類化合物,是中藥木香的主要化學(xué)成分和質(zhì)控成分之一。近年來研究表明木香烴內(nèi)酯具有廣泛的藥理活性,包括抗腫瘤、降血糖、抗菌、抗炎等作用[3]。新近研究還發(fā)現(xiàn),木香烴內(nèi)酯在動物模型中能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷,可以有潛力成為一個具有保肝作用的藥物[4]。本研究建立乙醇體外誘導(dǎo)人LO2肝細胞損傷模型,考察木香烴內(nèi)酯對肝細胞損傷及脂肪變性的保護作用與初步機制與可能靶標,為木香烴內(nèi)酯用于酒精性脂肪肝的防治提供實驗依據(jù)。
木香烴內(nèi)酯(純度99.08%)、AMPK抑制劑BML-275(純度99.73%)購自美國MedChemExpress公司,溶解于DMSO備用。Western blot實驗用一抗SREBP-1c、PPARα、p-AMPK、AMPK、GAPDH及二抗Goat Anti-Rabbit-IgG-HRP購自美國Cell Signaling Technology。
主要實驗儀器如下:光學(xué)顯微鏡 (日本Olympus公司)、超低溫冰箱(日本Sanyo公司)、CO2細胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)、超純水儀(美國Millpore公司)、核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)、Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)、多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)、電泳槽(美國Bio-Rad公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。
人LO2肝細胞購自中科院上海細胞庫。在含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
LO2細胞接種于96孔板,每孔180 μL,1×104個細胞/孔,加入乙醇和/或木香烴內(nèi)酯處理48 h。后加入5 mg/mL MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除上清,每孔加入200 μL DMSO充分溶解結(jié)晶物。在多功能酶標儀490 nm處測量各孔OD值,同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT)與對照孔(細胞、培養(yǎng)基、MTT),每組6個復(fù)孔。藥物處理組的細胞活力標示為對照組的百分比。
LO2細胞接種于6孔板,加入乙醇或木香烴內(nèi)酯處理48 h。取每組細胞上清液,按照試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)方法測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性。每組6個復(fù)孔,藥物處理組的ALT或AST水平表示為對照組的倍數(shù)。
LO2細胞接種于放有無菌蓋玻片的 24 孔培養(yǎng)板,加入乙醇和/或木香烴內(nèi)酯處理48 h。后以 PBS洗滌3遍,4%多聚甲醛固定30 min,0.5%油紅O染液(購自碧云天生物技術(shù)公司)室溫染色30 min,60%異丙醇漂洗30 s,蒸餾水洗30 s至背景透明,明膠甘油封片,顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂滴形成情況。
LO2細胞接種于6孔板,加入乙醇和/或木香烴內(nèi)酯處理48 h。后棄上清,PBS 洗滌細胞3遍,加入胰酶消化,收集細胞懸液,超聲細胞粉碎機裂解細胞2 min,離心取上清,按試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書方法檢測上清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的含量。每組6個復(fù)孔,藥物處理組的TG或TC水平表示為對照組的倍數(shù)。
LO2細胞接種于6孔板,加入乙醇、木香烴內(nèi)酯和/或BML-275處理48 h。細胞內(nèi)RNA提取按照Trizol Reagent說明書進行,紫外分光光度計檢測純度和定量。cDNA的合成采用40 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,其中M-MLV 200 U,oligo(dT)(15 primer)10 ng/mL,4×dNTP(10 mM)4 μL,5×RT buffer 8 μL,無RNase水補至40 μL。42 ℃反應(yīng)15 min,95 ℃滅活M-MLV酶5 min。根據(jù)Genebank資料自行設(shè)計引物(表1),由上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH作為內(nèi)參物,PCR擴增體系為20 μL,包含cDNA 2 μL,上下游引物(10 μM)各1 μL,SYBR Premix Ex Taq酶10 μL,用DEPC水補至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃、5 s;60 ℃、30 s,共擴增40個循環(huán)。測得目的基因擴增的動力學(xué)曲線與Ct值。目的基因mRNA的倍數(shù)改變通過與GAPDH相比較計算得出。
表1 引物序列
LO2細胞接種于6孔板,加入乙醇、木香烴內(nèi)酯和/或BML-275處理48 h。用冰冷的RIPA裂解液進行細胞裂解,收集裂解物,-80 ℃儲藏過夜。蛋白混合液融化,于4 ℃、12 000 rpm下離心15 min,吸取上清以BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg,進行SDS-PAGE電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,非特異性封閉;加入相應(yīng)一抗,4 ℃過夜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行雜交。加入ECL發(fā)光液,以凝膠成像儀(Bio-Rad)進行成像與半定量分析。
圖1 木香烴內(nèi)酯抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細胞損傷Fig.1 Costunolide inhibits ethanol-induced hepatocyte injury注:(A)MTT實驗檢測乙醇對LO2細胞活力的影響,與對照組相比,*P<0.05;(B)MTT實驗檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞活力的影響,與對照組相比,*P<0.05,與乙醇組相比,#P<0.05;(C)MTT實驗檢測木香烴內(nèi)酯在0-80 μM范圍內(nèi)對LO2細胞活力的影響;(D,E)試劑盒檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞上清ALT和AST水平的影響,與對照組相比,*P<0.05,與乙醇組相比,#P<0.05。Note:(A) MTT assay for detecting the effects of ethanol on LO2 cell viability,*P<0.05;(B) MTT assay for detecting the effects of Costunolide on ethanol-induced LO2 cell injury,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol;(C) MTT assay for detecting the effects of Costunolide at 0-80 μM on LO2 cell viability,(D,E) Measurements of supernatant ALT and AST levels in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol.
首先建立乙醇誘導(dǎo)的肝細胞損傷模型。MTT檢測結(jié)果顯示,當(dāng)乙醇濃度為100 mM或高于此濃度時顯著抑制LO2細胞活力,呈劑量依賴性(圖1A)。據(jù)此選擇濃度為100 mM的乙醇作為后續(xù)實驗中誘導(dǎo)肝細胞損傷的條件。以MTT實驗考察木香烴內(nèi)酯對乙醇誘導(dǎo)肝細胞損傷的影響,發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時可顯著改善乙醇對LO2細胞活力的抑制作用(圖1B),但單獨作用時,對LO2細胞活力沒有顯著影響(圖1C)。進一步考察木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的肝細胞上清液中ALT和AST水平的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,乙醇導(dǎo)致LO2細胞上清液中ALT和AST水平顯著升高,而木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時顯著降低乙醇刺激的LO2細胞上清液中ALT與AST含量(圖1D、1E)。上述結(jié)果表明,木香烴內(nèi)酯可以抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細胞損傷。
以油紅O染色檢測肝細胞中的脂滴堆積情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,100 mM濃度的乙醇作用48 h后可明顯促進LO2細胞中的脂質(zhì)生成;而木香烴內(nèi)酯在20、40 μM濃度時可抑制乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)生成(圖2A)。利用試劑盒檢測LO2細胞中TG和TC的水平,結(jié)果顯示與對照組對比,乙醇可顯著升高LO2細胞中TG的水平,而木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時顯著降低乙醇刺激的LO2細胞中的TG含量(圖2B)。類似地,乙醇也可顯著升高LO2細胞中TC的水平,而木香烴內(nèi)酯在20、40 μM濃度時顯著降低乙醇刺激的LO2細胞中的TC的含量(圖2C)。上述結(jié)果顯示,木香烴內(nèi)酯可以抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細胞脂質(zhì)生成。
圖2 木香烴內(nèi)酯抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細胞脂質(zhì)生成Fig.2 Costunolide inhibits ethanol-induced lipogenesis in hepatocytes注:(A)油紅O染色檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞中脂質(zhì)堆積的影響(放大倍數(shù):400X);(B)試劑盒檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞中TG含量的影響,與對照組相比,*P<0.05;與乙醇組相比,#P<0.05;(C)試劑盒檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞中TC含量的影響,與對照組相比,*P<0.05,與乙醇組相比,#P<0.05。Note:(A) Oil-red O staining for evaluating the effects of costunolide on ethanol-induced lipid accumulation in LO2 cells (400X magnification);(B) Measurement of intracellular TG levels in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol;(C) Measurement of intracellular TC levels in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol.
固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是對肝細胞中脂質(zhì)的合成具有重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子,其中SREBP-1c具有正向調(diào)控脂質(zhì)生成的作用[5],而PPARα起到負向調(diào)節(jié)作用[6]。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,乙醇可顯著促進LO2細胞中SREBP-1c的mRNA表達,而抑制PPARα的mRNA表達;與乙醇模型組相比,木香烴內(nèi)酯在20和40 μM濃度時顯著降低SREBP-1c的mRNA表達并上調(diào)PPARα的mRNA表達(圖3A)。以Western blot檢測SREBP-1c和PPARα的蛋白表達。結(jié)果顯示,與對照組相比,乙醇可顯著促進LO2細胞中SREBP-1c的蛋白表達,而抑制PPARα的蛋白表達;與乙醇模型組相比,木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時顯著降低SREBP-1c的蛋白表達并上調(diào)PPARα的mRNA表達(圖3B)。綜合上述表明,木香烴內(nèi)酯能夠調(diào)控肝細胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達,與改善乙醇誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性相關(guān)。
圖3 木香烴內(nèi)酯調(diào)控肝細胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達Fig.3 Costunolide regulates the expression of lipogenesis-related transcription factors in hepatocytes注:(A)Real-time PCR檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞中SREBP-1c、PPARα的mRNA表達的影響,與對照組相比,**P<0.01,與乙醇組相比,#P<0.05,##P<0.01;(B)Western blot檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞中SREBP-1c、PPARα的蛋白表達的影響,與對照組相比,**P<0.01,與乙醇組相比,#P<0.05,##P<0.01。Note:(A) Real-time PCR analyses for evaluating the effects of costunolide on mRNA expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated O2 cells treated with costunolide,**P<0.01 vs control,#P<0.05 vs ethanol,##P<0.01 vs ethanol;(B) Western blot analyses for evaluating the effects of costunolide on protein expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,**P<0.01 vs control,#P<0.05 vs ethanol,##P<0.01 vs ethanol.
進一步探究木香烴內(nèi)酯的可能作用靶標。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是細胞的能量感受器,在肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用,可以成為藥物干預(yù)酒精性脂肪肝的分子靶標[7]。Western blot檢測結(jié)果顯示,乙醇顯著抑制LO2細胞中AMPK的磷酸化,而木香烴內(nèi)酯在20、40μM時顯著上調(diào)乙醇刺激的LO2細胞中AMPK的磷酸化(圖4A),提示能夠增強AMPK的活性。以AMPK的特異性抑制劑BML-275作為工具藥,考察木香烴內(nèi)酯對肝細胞脂質(zhì)的調(diào)控是否依賴于激活A(yù)MPK。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,BML-275在10μ時顯著削弱木香烴內(nèi)酯對SREBP-1c基因表達的抑制作用,同時削弱對PPARα基因表達的上調(diào)作用(圖4B)。Western blot檢測結(jié)果顯示,BML-275在蛋白水平也產(chǎn)生相似的作用(圖4C)。上述結(jié)果表明,木香烴內(nèi)酯依賴于激活A(yù)MPK調(diào)控肝細胞中脂質(zhì)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達。
長期過量攝入酒精,肝臟無法將其完全代謝,將導(dǎo)致體內(nèi)諸多生理、生化和代謝平衡失調(diào),造成肝細胞損傷,進而引發(fā)酒精性肝臟疾病的發(fā)生。酒精性脂肪肝發(fā)展為肝纖維化和肝硬化的危險性比單純性脂肪肝更高。一方面,酒精在肝臟通過CYP2E1代謝產(chǎn)生活性氧自由基,引起脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng),在肝臟內(nèi)生成脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,造成肝細胞損傷,導(dǎo)致肝細胞凋亡或壞死;另一方面,進入肝細胞的酒精在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?,再轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?,后一反?yīng)使氧化型輔酶I
圖4 木香烴內(nèi)酯通過激活A(yù)MPK調(diào)控肝細胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達Fig.4 Activation of AMPK is required for costunolide to regulate the expression of lipogenesis-related transcription factors in hepatocytes注:(A)Western blot檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細胞中AMPK磷酸化的影響,與對照組相比,**P<0.01,與乙醇組相比,##P<0.01;(B)Real-time PCR檢測木香烴內(nèi)酯及其與BML-275聯(lián)用時對乙醇刺激的LO2細胞中SREBP-1c、PPARα的mRNA表達的影響,與對照組相比,**P<0.01,與乙醇組相比,##P<0.01,與木香烴內(nèi)酯組相比,&P<0.05;(C)Western blot檢測木香烴內(nèi)酯及其與BML-275聯(lián)用時對乙醇刺激的LO2細胞中SREBP-1c、PPARα的蛋白表達的影響,與對照組相比,**P<0.01,與乙醇組相比,##P<0.01,與木香烴內(nèi)酯組相比,&&P<0.01。Note:(A) Western blot analyses for evaluating the effects of costunolide on AMPK phosphorylation in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,##P<0.01 vs ethanol;(B) Real-time PCR analyses for evaluating the effects of costunolide on mRNA expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide and/or BML-275,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs ethanol,&P<0.05 vs costunolide;(C) Western blot analyses for evaluating the effects of costunolide on protein expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide and/or BML-275,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs ethanol,&&P<0.01 vs costunolide.
(NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶I(NADH),因而NADH與NAD比值升高。NADH/NAD比值的升高可抑制細胞線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán),使肝內(nèi)脂肪酸代謝發(fā)生障礙,氧化分解減弱,從而導(dǎo)致脂肪堆積于肝細胞中;另外,NADH/NAD比值的升高促進了脂肪酸的合成,也導(dǎo)致脂肪在肝細胞中堆積,最終導(dǎo)致了脂肪肝形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn),乙醇在100 mM濃度下對人LO2肝細胞作用48 h可以顯著抑制肝細胞的活力,促進轉(zhuǎn)氨酶的釋放,并增加細胞內(nèi)脂質(zhì)成分的生成與集聚,提示形成了酒精體外誘導(dǎo)肝細胞損傷與脂肪變性的模型,這一模型可用于考察藥物體外對酒精性脂肪肝的干預(yù)作用。
木香烴內(nèi)酯是一個受到廣泛關(guān)注的藥用天然產(chǎn)物。早先有研究發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯能夠抑制機體胃腸道對酒精的吸收,提示對酒精導(dǎo)致的肝損傷有潛在的保護作用[9]。越來越多的證據(jù)表明木香烴內(nèi)酯對肝臟具有多種藥理作用,如通過阻斷NF-κB信號通路改善急性肝損傷[4],抑制肝細胞表達乙肝病毒表面抗原[10],抑制肝臟中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[11],以及阻斷肝癌細胞的周期進而抑制其增殖[12]。據(jù)此,本論文旨在探討木香烴內(nèi)酯對酒精性脂肪肝的潛在干預(yù)作用與機制,發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯體外對正常肝細胞活力沒有顯著影響,但可以顯著改善酒精誘導(dǎo)的肝細胞損傷以及脂質(zhì)成分的合成,尤其是降低細胞內(nèi)TG和TC水平的升高。肝臟是合成和貯存TG和TC的主要器官。脂肪性肝病以肝細胞內(nèi)TG和TC蓄積過多和彌漫性肝細胞脂肪變性為主要病理特征。在酒精性脂肪肝進程中,乙醇聯(lián)合游離脂肪酸能夠降低線粒體脂肪酸β氧化能力,使TG和TC大量沉積于肝臟[13]。因此,木香烴內(nèi)酯抑制肝細胞內(nèi)TG和TC生成的作用可能是其改善酒精性脂肪肝的重要途徑之一。
本研究進一步從肝細胞脂質(zhì)成分轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角度探討木香烴內(nèi)酯的作用機制。SREBP是調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子,共分為三種SREBP亞型,它們在脂質(zhì)合成中各自起到不同的作用,其中SREBP-1c是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控者,幾乎參與所有肝臟甘油三酯和脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄。SREBP-1c的過度表達將引起糖脂代謝的異常,使產(chǎn)脂量大幅提升,進而導(dǎo)致肝臟等非脂肪組織的脂質(zhì)積聚[14]。PPARα是一個主要在肝臟表達的核轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)脂肪酸β氧化及脂蛋白合成中相關(guān)基因的表達,促進肝臟脂代謝,改善胰島素抵抗。PPARα的缺乏或低表達可以使肝臟脂質(zhì)的利用和脂肪酸的氧化發(fā)生障礙,導(dǎo)致肝臟甘油三酯沉積、糖脂代謝紊亂[15]。有研究發(fā)現(xiàn),PPARα的拮抗劑GW6471可加重糖尿病脂肪肝小鼠肝臟炎癥反應(yīng),而PPARα的激動劑WY14643可提高糖尿病脂肪肝小鼠脂肪變性程度[16]。因此,SREBP-1c與PPARα二者在細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝方面產(chǎn)生相反的調(diào)控作用,并且存在相互關(guān)聯(lián),如有研究發(fā)現(xiàn)PPARα可抑制SREBP-1c的活性,從而減少脂肪酸和TG的合成[17]。本論文研究發(fā)現(xiàn)在乙醇刺激的LO2細胞中,木香烴內(nèi)酯可顯著下調(diào)SREBP-1c的表達并恢復(fù)PPARα的表達,這一作用可能是木香烴內(nèi)酯抑制LO2細胞內(nèi)TG、TC等脂質(zhì)成分合成的上游事件。這些結(jié)果也提示木香烴內(nèi)酯可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)生成。進一步發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯的作用依賴于激活A(yù)MPK。AMPK是廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合體,在應(yīng)激情況下,AMPK 磷酸化后激活,通過限制合成代謝減少ATP的消耗和促進分解代謝增加ATP的生成來維持機體穩(wěn)態(tài)[18]。本研究結(jié)果提示木香烴內(nèi)酯減少乙醇誘導(dǎo)的肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量可能與激活A(yù)MPK,進而影響脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。后續(xù)工作將進一步探究木香烴內(nèi)酯如何激活肝細胞中的AMPK。
綜合本研究的結(jié)果表明,木香烴內(nèi)酯可能通過激活A(yù)MPK,調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c與PPARα的表達,進而減少肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)生成與集聚。這一發(fā)現(xiàn)為木香烴內(nèi)酯作為酒精性脂肪肝的潛在防治藥物的進一步研究提供實驗依據(jù)。