梁 波,章曉軍,楊振興

(1.象山縣第一人民醫(yī)院泌尿外科，浙江寧波 315700；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，重慶 400037)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，腎癌的發(fā)病率(66.8/100 000)和致死率(23.4/100 000)也在增加，其中大部分是腎臟細(xì)胞癌，而腎臟細(xì)胞癌中又以透明細(xì)胞癌占大多數(shù)[1]。目前，大部分腎癌患者的診斷都是通過體檢發(fā)現(xiàn)，然后再輔助精確的病理檢查，雖然局限性腎癌超過50%，但是仍然有30%的腎癌患者在診斷時(shí)就已經(jīng)轉(zhuǎn)移[2-3]。Polo樣激酶(PLK)是參與有絲分裂進(jìn)入與退出，紡錘體形成，胞質(zhì)分裂和減數(shù)分裂細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的一類激酶，在果蠅、萌芽酵母和裂殖酵母的基因組中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)PLK表達(dá)。然而，脊椎動(dòng)物有許多PLK家族成員，包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4和PLK5。在脊椎動(dòng)物PLK家族成員中，哺乳動(dòng)物PLK1已被廣泛研究[4]。人類PLK5基因也是最近發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期循環(huán)的關(guān)鍵激酶，在人類神經(jīng)元分化和腫瘤形成中發(fā)揮重要作用[5]。并且，最近的研究顯示PLK5調(diào)控細(xì)胞周期參與腎臟透明細(xì)胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5-6]。因此，本研究將探索PLK5蛋白參與腎臟透明細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展的作用機(jī)制，旨在闡述PLK5可能對(duì)腎癌轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的潛在影響，并可能成為后續(xù)臨床用藥和治療的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 所有腎癌組織標(biāo)本均來自象山縣第一人民醫(yī)院和陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，參與患者均被告知參與研究，并且通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系購自上海中喬新舟生物科技有限公司；CCK-試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司； FITC nexinV凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；PLK5抗體購自CST公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 細(xì)胞和組織RNA的提取，在使用TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL氯仿劇烈振蕩管體15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層及無色水相上層。加入異丙醇沉淀和提取，分離保存RNA。運(yùn)用SYBR Green染料試劑盒，按照操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測。

1.2.2蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot) 采用Western blot檢測PLK5蛋白表達(dá)情況，步驟如下:分別收集腎癌細(xì)胞系和組織標(biāo)本，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，冰浴20 min。離心，收集上清液，采用二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白水平。各組取等量總蛋白加上樣緩沖液，煮沸變性5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，10%脫脂奶粉封閉1 h，將對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量條帶剪下后分別用一抗PLK5在4 ℃孵育過夜后，加相應(yīng)二抗孵育1 h，膜上滴加化學(xué)發(fā)光劑在暗室進(jìn)行曝光顯影。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色 組織標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色步驟如下:切片常規(guī)脫蠟，緩沖液PBS洗3次，每次5 min，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block中孵育10～15 min，緩沖液洗3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛固定20 min，棄4%多聚甲醛后用PBS洗滌2次，滴加一抗工作液37 ℃孵育1～2 h，或抗CX43抗體的PBS-BSA (1∶200) 孵育，4 ℃過夜。向1 mL DAB Plus Substrate(或AEC Plus Substrate)中滴加1～2滴DAB Plus Chromogen(或AEC Plus Chromogen)，混勻后滴加到切片上，孵育3～15 min。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min，顯色劑顯色3～15 min(DAB或NBT/BCIP)，錫箔紙包裹置于37 ℃溫箱孵育1 h，PBS洗滌3次，每次3 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4慢病毒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 慢病毒構(gòu)建是由吉瑪生物公司協(xié)助完成，所有腎癌細(xì)胞系培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育培養(yǎng)。六孔板細(xì)胞沒空感染20 mL慢病毒，24 h以后觀測熒光強(qiáng)度，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5CCK-8檢測和劃痕實(shí)驗(yàn) CCK-8檢測使用購買自碧云天的CCK8試劑盒，取對(duì)數(shù)生長期的上述腎癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入90 μL 1640培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，放細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測450 nm波長各孔吸光度值。劃痕實(shí)驗(yàn)具體步驟:先用marker筆在6孔板背后均勻地劃橫線；在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同；PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；使用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 OSRC2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后鋪6孔板，每孔2 mL培養(yǎng)基，生長至80%后經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的75%乙醇4 ℃固定過夜，離心收集細(xì)胞，進(jìn)行流失細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞周期改變。

2 結(jié) 果

2.1PLK5基因參與腎臟透明細(xì)胞癌的進(jìn)展和預(yù)后 來自癌癥數(shù)據(jù)庫TCGA的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)分析表明，腎癌患者PLK5蛋白的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(n=145vs.n=22，P<0.01，圖1A)；并且這種高表達(dá)集中在腎癌的高級(jí)階段(階段Ⅳ，n=84，P<0.01，圖1B)；來自30對(duì)腎癌及癌旁組織的臨床數(shù)據(jù)也提示PLK5在腎癌患者中高表達(dá)(P<0.01，圖1C)；另外，生存分析數(shù)據(jù)也顯示，PLK5高表達(dá)者預(yù)后較低表達(dá)者差(P=0.002 2，圖1D)，特別是在PLK5高表達(dá)并且病理分級(jí)高的患者中生存率明顯降低(P<0.01，圖1E)。

2.2PLK5蛋白在腎癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)情況 在4種腎癌細(xì)胞系(769-P、OSRC2、786-O、Caki-2)和人正常腎臟上皮永生化細(xì)胞HK2中檢測PLK5表達(dá)情況，結(jié)果顯示，無論是Western blot(P<0.01，圖2A)還是RT-PCR(P<0.01，圖2B)實(shí)驗(yàn)均表明OSRC2細(xì)胞中PLK5表達(dá)較其他細(xì)胞類型高。對(duì)臨床腎透明細(xì)胞癌患者的腫瘤及其癌旁組織的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在腎臟透明細(xì)胞癌中PLK5主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管(圖2C)，且主要定位在細(xì)胞核，表達(dá)水平高，而在癌旁正常組織(圖2D)PLK5蛋白表達(dá)水平低。

A:PLK5在癌組織和癌旁組織中的RNA測序結(jié)果；B:癌癥不同分期PLK5的表達(dá)水平；C:收集的臨床標(biāo)本PLK5 mRNA表達(dá)水平；C:不同表達(dá)水平患者生存曲線；D:不同表達(dá)腫瘤級(jí)別患者生存曲線；a:P<0.01，與癌旁組織/正常組織比較
圖1 PLK5與腎癌進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系

A:Western blot檢測PLK5在腎癌細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)；B:RT-PCR檢測PLK5在腎癌細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)；C:腎臟透明細(xì)胞癌組織的免疫組織化染色；D:正常腎臟組織免疫組織化染色；a:P<0.01，與HK2細(xì)胞比較
圖2 PLK5蛋白在腎癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)

2.3RNA干擾PLK5蛋白的效率分析 構(gòu)建3種PLK5干擾病毒，分別轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞系OSRC2和正常腎臟上皮細(xì)胞系HK2，免疫熒光觀察顯示慢病毒感染效率高(>90%，圖3C、D)。而結(jié)果分析顯示，第3種RNA干擾標(biāo)簽效果最好，無論是RT-PCR(P<0.01，圖3A)還是Western blot(P<0.01，圖3B)實(shí)驗(yàn)都顯示PLK5蛋白表達(dá)水平低于其他對(duì)照組。因此后續(xù)研究均以第3類干擾RNA做分析。

A:Western blot檢測顯示3種RNA干擾效率；B:RT-PCR檢測顯示3種RNA干擾效率；C:OSRC2腎癌細(xì)胞干擾RNA-3的白光；D:OSRC2腎癌細(xì)胞干擾RNA-3的熒光；a:P<0.01，與同細(xì)胞系干擾RNA-3比較
圖3 RNA干擾PLK5蛋白表達(dá)的效率分析

2.4PLK5蛋白干擾明顯影響腎癌細(xì)胞的表型 分析PLK5蛋白干擾以后的細(xì)胞表型，CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，干擾組較對(duì)照組OSRC2細(xì)胞48 h以后增殖明顯減慢(P<0.01，圖4A)，而劃痕實(shí)驗(yàn)也證實(shí)干擾組細(xì)胞遷移速度明顯減慢，24 h測量兩組劃痕距離有明顯差異(P<0.01，圖4B)。由于干擾后，OSRC2細(xì)胞增殖速度明顯減慢，所以隨后檢測的細(xì)胞周期也發(fā)現(xiàn)hRNA3組細(xì)胞周期阻滯在S期(P<0.01，圖4C)。

A:干擾組和對(duì)照組的CCK8增殖實(shí)驗(yàn)；B:干擾組和對(duì)照組的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)；C:干擾組和對(duì)照組的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)；a:P<0.01，與對(duì)照組比較
圖4干擾PLK5蛋白表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞表型的影響

A:22對(duì)癌組織和癌旁組織基因RNA-seq表達(dá)熱圖分析；B:GSEA分析顯示細(xì)胞循環(huán)通路中大部分基因在癌組織中被激活
圖5信號(hào)通路分析

2.5PLK5蛋白通過抑制腎癌細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生作用 運(yùn)用癌癥TCGA數(shù)據(jù)庫中癌組織和癌旁組織(22對(duì))的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)，在軟件基因組表達(dá)富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)中分析結(jié)果顯示，與PLK5相互作用的蛋白(圖5A)均參與了腎癌細(xì)胞的進(jìn)展，這些基因均參與了細(xì)胞周期G1到S期的調(diào)控(圖5B)。明顯富集的細(xì)胞周期通路為細(xì)胞循環(huán)(cell cycle，P<0.01，F(xiàn)DRq=0.014)。

3 討 論

在當(dāng)前的研究中，前期的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PLK5蛋白在腎臟透明細(xì)胞癌患者中表達(dá)增加，尤其表現(xiàn)在腎癌的高級(jí)階段的患者中，并且生存分析顯示PLK5基因表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)患者預(yù)后明顯較差。在接下來的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，作者證實(shí)干擾PLK5基因表達(dá)可以明顯干擾細(xì)胞周期S階段，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是透明細(xì)胞癌最常見的轉(zhuǎn)移方式，檢測與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)對(duì)于診斷和干預(yù)是非常有價(jià)值的[9]。盡管許多原發(fā)基因突變(如VHL、PBRM1、SETD2、BAP1等)可以導(dǎo)致腎癌的發(fā)生，但是哪些基因參與腎癌轉(zhuǎn)移仍然未知[3]。由于腫瘤巨大的異質(zhì)性，鑒定轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因比較困難[10]。越來越多的證據(jù)顯示，PLK5參與腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PLK5激酶是哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與細(xì)胞循環(huán)的一類最重要的激酶，在小鼠NIH3T3細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)PLK5 cDNA可以明顯誘導(dǎo)G1期靜止，增加S階段細(xì)胞循環(huán)，作為腫瘤細(xì)胞的抑制子是G1/S階段的重要調(diào)控蛋白[5，11]。PLK5基因定位在人類染色體19p13.3，全長11.4 kb，包含14個(gè)外顯子，以及PBD1和PBD2兩個(gè)主要功能域，缺乏激酶活性結(jié)構(gòu)域，與PLK2和PLK3有極大同源性[5，12]。PLK5蛋白主要定位在細(xì)胞核，腫瘤細(xì)胞中PLK5表達(dá)可以抑制G1期進(jìn)入S階段，并且誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和DNA損傷[13-14]。另外，還有研究顯示，PLK5特異的甲基化調(diào)控可以在腫瘤患者體內(nèi)控制PLK5表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15-16]。

本研究在腎臟細(xì)胞癌模型中檢測PLK5蛋白的作用，研究顯示PLK5蛋白在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)增加可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，與腫瘤細(xì)胞遷移有很大關(guān)聯(lián)，并且信號(hào)通路分析顯示，與PLK5相互作用的蛋白在腎癌患者中有共同的作用，所有這些研究提示PLK5蛋白與腎臟透明細(xì)胞癌的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。