（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

自1996年轉(zhuǎn)基因作物在美國(guó)首次商業(yè)化大規(guī)模種植以來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域得到了快速的應(yīng)用與發(fā)展，并且隨著其種植面積的不斷擴(kuò)大，已經(jīng)對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)方式產(chǎn)生了巨大而深刻的影響。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）于2018年6月發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2017年種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家已經(jīng)達(dá)到24個(gè)，并且全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的174萬(wàn)公頃增加到2017年的1.898億公頃，增長(zhǎng)種植面積超過(guò)了110倍［1］。隨著轉(zhuǎn)基因作物的迅猛發(fā)展，關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品成分食用和環(huán)境安全性的爭(zhēng)議也與日俱增，世界各國(guó)都在不同程度上制訂了相應(yīng)的管理制度，主要包括轉(zhuǎn)基因的安全性評(píng)價(jià)制度和轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)制度等［2-4］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其相關(guān)制品的檢測(cè)主要是針對(duì)其含有的外源蛋白和外源核酸展開(kāi)的，并且已經(jīng)建立了一系列轉(zhuǎn)基因定性和定量檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、基因芯片技術(shù)（gene chip）及數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR）等［5-6］。

我國(guó)對(duì)待轉(zhuǎn)基因采取比較謹(jǐn)慎的態(tài)度，于2001年相繼頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》及一系列管理辦法，對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實(shí)行安全評(píng)價(jià)、產(chǎn)品標(biāo)識(shí)、生產(chǎn)許可、經(jīng)營(yíng)許可、進(jìn)口許可、加工許可等方面管理［7-8］。目前我國(guó)實(shí)施的是沒(méi)有閾值的標(biāo)識(shí)制度，規(guī)定來(lái)源于玉米、大豆、番茄等五種作物的17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)［9-12］。然而市場(chǎng)上一些散裝售賣(mài)的農(nóng)作物加工品普遍存在缺乏明顯標(biāo)識(shí)的現(xiàn)象，且深加工制品一般核酸會(huì)受到不同程度的破壞，不便于檢測(cè)與監(jiān)管［13］。

本文參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中提供的植物基因組提取方法，通過(guò)對(duì)試劑盒法、胍-氯仿法和CTAB法提取食品中基因組DNA效果進(jìn)行比較，選擇出DNA回收率高、純度高的方法用于后續(xù)的PCR檢測(cè)，然后針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品中一些常見(jiàn)的外源基因及調(diào)控元件設(shè)計(jì)出特異性引物，構(gòu)建普通PCR的檢測(cè)方法，并且擴(kuò)增片段都小于200bp以適用于深加工品的檢測(cè)，為監(jiān)管部門(mén)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

非轉(zhuǎn)基因玉米種子黏墾、非轉(zhuǎn)基因大豆種子合豐、陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57-TP（見(jiàn)圖1）為本實(shí)驗(yàn)室保存，轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、MIR162，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2（5%），陽(yáng)性質(zhì)粒pBJGMM001（見(jiàn)圖2）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供［14］，豆?jié){粉、豆芽購(gòu)自超市。

圖1 pUC57-TP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

圖2 pBJGMM001質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

PCR反應(yīng)試劑（上海生工生物工程股份有限公司），EDTA、異丙醇、NaOH（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司），NaCl、無(wú)水乙醇、氯仿、異戊醇（北京化工廠），PVP40000（寶泰克生物科技公司），Proteinase K（Genview），Tris（BioFroxx），CTAB（上海源葉生物），β-巰基乙醇、Tris飽和酚（北京鼎國(guó)生物）、質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生物科技公司）、植物基因組提取試劑盒（艾德萊生物）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀（LifeTouch公司），離心機(jī)（Eppendorf公司），電泳槽，電泳儀，凝膠成像儀Azure c300（azure biosystems公司），微量核酸測(cè)定儀Nanodrop One（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組DNA提取

參照GB/T 19495.3-2004中基因組DNA的CTAB提取方法［15］、胍-氯仿法，及購(gòu)買(mǎi)的植物基因組提取試劑盒分別對(duì)豆芽、豆?jié){粉、大豆種子的基因組進(jìn)行提取，每種方法設(shè)置兩組重復(fù)。將DNA沉淀用去離子水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)判斷所提取植物及其加工品基因組DNA的完整度，再用微量核酸及蛋白測(cè)定儀Nanodrop One對(duì)提取DNA的濃度和純度進(jìn)行測(cè)定分析。

2.2 陽(yáng)性質(zhì)粒分子的提取

從-80℃冰箱中取出凍存的菌株，將其按1∶100接種到氨芐青霉素終濃度為100μg/mL的5mL LB培養(yǎng)基中，在37℃下180rpm振蕩過(guò)夜，再將菌液在4℃下離心分離，使用天根Mini Plasmid Kit提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，操作步驟參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

將質(zhì)粒溶液保存在1.5mL離心管中，通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)判斷質(zhì)粒DNA的提取情況。

2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、CaMV35S終止子、NOS啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、Hpt、CP4-EPSPS、Cry1A.105、Cry2Ab2九種不同基因的核苷酸序列，使用Oligo 7.0設(shè)計(jì)出特異性引物，玉米內(nèi)參zSSIIb、大豆內(nèi)參Lectin的引物序列參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19495.4-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定性PCR檢測(cè)方法》［16］，引物的詳細(xì)信息見(jiàn)表1，并由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成和純化，用去離子水稀釋成100μM備用。

2.4 PCR反應(yīng)體系及條件

PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表3。

表1 引物序列

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)條件

2.5 電泳檢測(cè)

吸取PCR產(chǎn)物10μL，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為0.5×TBE電泳緩沖液，設(shè)置水空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，以DL2000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)尺，在100V電壓下電泳30min，通過(guò)EB染色［17-18］，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同基因組提取方法比較

分別用植物基因組試劑盒法、CTAB法和鹽酸胍-三氯甲烷法對(duì)豆芽、豆?jié){粉、大豆種子中的基因組DNA進(jìn)行提取，從電泳結(jié)果和核酸含量測(cè)定中可以看出，相同質(zhì)量的樣品用CTAB法提取到的基因組DNA的含量和純度最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用CTAB法提取食品中DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證。

圖3 三種不同方法對(duì)不同樣品基因組提取結(jié)果

表4 不同方法提取核酸含量測(cè)定結(jié)果

3.2 陽(yáng)性質(zhì)粒提取

從圖4、圖5電泳結(jié)果可以看出，所提取的陽(yáng)性質(zhì)粒條帶明亮清晰，可適用于后續(xù)的PCR檢測(cè)。

圖4 pUC57-TP質(zhì)粒提取結(jié)果

圖5 pBJGMM001質(zhì)粒提取結(jié)果

3.3 PCR檢測(cè)方法特異性驗(yàn)證

以空白對(duì)照（水）、陰性樣本、陽(yáng)性樣本（或陽(yáng)性質(zhì)粒）作為實(shí)驗(yàn)材料，分別對(duì)9種基因的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示。從中可以看出9種基因的檢測(cè)方法均能從陽(yáng)性樣本（或陽(yáng)性質(zhì)粒）中得到預(yù)期大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，而在陰性樣本、空白對(duì)照及不含目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因樣本中均未出現(xiàn)擴(kuò)增（部分有引物二聚體出現(xiàn)），說(shuō)明該檢測(cè)方法具備高度特異性。

圖7 不同基因PCR檢測(cè)方法的靈敏度

圖6 PCR檢測(cè)方法特異性結(jié)果

3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證

將PCR擴(kuò)增得到的9種擴(kuò)增產(chǎn)物送去生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已知的目標(biāo)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)9種PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與已知序列基本一致，驗(yàn)證了擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性。

3.5 PCR檢測(cè)方法的靈敏度試驗(yàn)

將提取的基因組DNA稀釋至200ng/μL，那么50ng/反應(yīng)，因?yàn)橛衩谆蚪M大小為2500Mbp，所以約18242 copies/反應(yīng)，pBJGMM001質(zhì)粒與pUC57-TP質(zhì)粒大小分別為5078bp、3169bp，200ng/μL玉米基因組拷貝數(shù)分別等同于質(zhì)粒40.623×10-5ng/μL、25.351×10-5ng/μL，然后將陽(yáng)性質(zhì)粒與陰性玉米混合成不同的百分含量，同時(shí)也將MON89034、GTS40-3-2、MIR162與非轉(zhuǎn)基因樣品按質(zhì)量比進(jìn)行混合，制備成5%、1%、0.5%、0.1%的梯度，進(jìn)行靈敏度測(cè)試。從圖7結(jié)果中可以看出，p35S、tNOS、Hpt、t35S、pNOS、pFMV35S、Cry2Ab2的PCR檢測(cè)方法均可從含量0.1%的樣品中擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的PCR產(chǎn)物，而CP4-EPSPS、Cry1A.105能從含量0.5%的樣品中得到擴(kuò)增（詳細(xì)信息見(jiàn)表5），能夠滿足對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。其中，MIR162中由于含有的t35S片段太短與引物序列不一致，所以并未得到擴(kuò)增。

表5 9種檢測(cè)方法檢測(cè)限與適用性

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)CTAB法、胍-氯仿法和試劑盒法三種植物基因組提取方法進(jìn)行比較，篩選出提取率最大、提取純度最高的CTAB法用于本實(shí)驗(yàn)樣品基因組的提取。以Lectin基因、zSSIIb基因分別為大豆、玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物中9種常見(jiàn)的外源基因序列為模板，設(shè)計(jì)出9對(duì)引物，建立了定性PCR的檢測(cè)方法，該方法具有高度的特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%～0.5%，滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)要求。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的種類(lèi)也在不斷增加，據(jù)ISAAA于2018年發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因玉米單品系現(xiàn)有44種，轉(zhuǎn)基因大豆單品系現(xiàn)有25種。目前，國(guó)家發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文件中公布了18種篩選檢測(cè)基因、15種大豆品系、23種玉米品系PCR檢測(cè)方法的推薦標(biāo)準(zhǔn)，本文就其中p35S、tNOS、Hpt、t35S、pNOS、pFMV35S、CP4-EPSPS、Cry1A.105、Cry2Ab2九種基因構(gòu)建了定性PCR檢測(cè)方法，后期將進(jìn)一步增加篩選檢測(cè)和品系檢測(cè)的覆蓋范圍，并開(kāi)發(fā)出定量檢測(cè)的熒光PCR和數(shù)字PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因，為我國(guó)的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管提供依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。