吳樹寧,王 凱,施 思,夏中元

(武漢大學人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;*通訊作者,E-mail:xiazhongyuan2005@aliyun.com)

細胞焦亡是一種炎癥反應相關的程序性細胞死亡方式,由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)依賴性介導,伴有大量促炎因子的釋放,誘發(fā)級聯(lián)放大的炎癥反應[1]。在病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)的作用下激活NLRP3炎性小體。其中,PAMPs(如核酸、脂蛋白、脂多糖)激活TLR4(Toll like receptor 4)信號通路,促進核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)激活介導IL-1β和IL-18等前體產(chǎn)生;DAMPs(如尿酸、ATP)促進NLRP3炎性小體蛋白復合物組裝,procaspase-1剪切成活化形式,活化的caspase-1將IL-1β和IL-18前體剪切活化釋放到胞外,進而引起細胞焦亡,導致細胞損傷[2-4]。

大黃素是存在于大黃和許多其他植物中的天然蒽醌,是中藥大黃的主要有效單體,具有抗病毒、抗癌癥和免疫抑制作用[5-8]。此外,有多項研究表明,大黃素在抗炎方面也有重要作用[9-11],在主動脈內(nèi)皮細胞中,大黃素可以通過抑制NF-κB和TNF-α活化,進而抑制炎癥反應[12],而在血管平滑肌細胞中,大黃素可以通過ROS-ERK1/2/p38通路抑制C反應蛋白的產(chǎn)生,進而抑制炎癥反應[13],目前,大黃素在HUVEC中的研究主要集中在通透性方面[14],細胞焦亡作為一種炎性程序性細胞死亡方式,大黃素是否可以通過減輕內(nèi)皮細胞焦亡,從而減輕內(nèi)皮細胞的損傷尚未見研究。本研究擬探討大黃素對內(nèi)皮細胞焦亡的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細胞購自于YRGene(NC006),RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶購自于美國Hyclone公司,胎牛血清為美國Sciencell公司產(chǎn)品,LPS、ATP、大黃素(純度≥98%,批號:E7881)、ROS檢測試劑盒為美國Sigma公司產(chǎn)品,CCK-8試劑盒為日本同仁公司產(chǎn)品,LDH檢測試劑盒為中國南京建成公司。NLRP3抗體、caspase-1抗體、IL-1β抗體、IL-18抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品,羊抗兔熒光二抗為美國Millpore公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

HUVEC細胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細胞密度為90%左右時,去掉培養(yǎng)液,用PBS洗滌細胞3次,吸干培養(yǎng)皿內(nèi)液體,加0.25%的胰酶將貼壁細胞消化分離,輕輕吹打均勻,使細胞徹底從培養(yǎng)皿底壁脫落,進行傳代培養(yǎng),每隔3-4 d傳代一次。取處于對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

1.3 細胞活力檢測

取HUVEC細胞懸液加入96孔板(每孔約1×104個細胞),加入不同濃度的大黃素溶液(0,20,40,60,80,100 μmol/L),持續(xù)培養(yǎng)24 h,換液后,每個孔分別加入10%的CCK-8溶液100 μl,在培養(yǎng)箱中孵育1 h,用酶標儀檢測450 nm出的吸光度,計算細胞存活率。另外,取對照組、LPS/ATP組、EMO組細胞懸液,用上述方法分別檢測各組細胞活力,細胞活力(% )=[A加藥-A空白]/[A未加藥-A空白]×100%。

1.4 分組

將HUVEC隨機分為三組:正常對照組(C組),正常條件下培養(yǎng)細胞;LPS/ATP組,用1 μg/ml脂多糖(LPS)刺激細胞24 h,再用5.5 mmol/L三磷酸腺苷(ATP)刺激細胞4 h;EMO組,先用大黃素60 μmol/L預處理細胞24 h,然后用1 μg/ml脂多糖(LPS)刺激細胞24 h,再用5.5 mmol/L三磷酸腺苷(ATP)刺激細胞4 h。

1.5 乳酸脫氫酶檢測

取各組經(jīng)過處理的細胞上清液,按照檢測試劑盒說明書操作步驟,用酶標儀在450 nm處檢測各組樣本的吸光度,計算各組乳酸脫氫酶的活性。

1.6 活性氧檢測

將消化后的細胞懸液加入6孔板(每孔約1×105個細胞),按照上述分組方法給藥。按照ROS檢測試劑盒說明書操作步驟,收集細胞后,加入DCFH-DA(1 mmol/L)工作液,在37 ℃,5% CO2的環(huán)境中避光溫育30 min,檢測各組細胞的ROS水平。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達

取各組培養(yǎng)的細胞,去除培養(yǎng)基后,經(jīng)PBS洗兩次后加入裂解液裂解細胞,收集蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度,取20 μg上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h。分別用抗體NLRP3(1 ∶500)、caspase-1(1 ∶500)、IL-1β(1 ∶1 000)、IL-18(1 ∶1 000)進行4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次,每次10 min,加入對應熒光二抗(1 ∶10 000),室溫孵育1 h。洗膜3次,每次10 min,使用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀(Li-Cor公司,美國)掃描熒光蛋白條帶,用Odyssey系統(tǒng)軟件進行結(jié)果分析,通過目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 細胞活性

當大黃素濃度在0-60 μmol/L之間時,細胞活力逐漸增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),當大黃素濃度超過80 μmol/L時,細胞活力明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1A),故選用大黃素60 μmol/L進行后續(xù)實驗。如圖1B所示,與對照組相比較,經(jīng)過LPS/ATP處理后,細胞活力明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與LPS/ATP組相比較,加入大黃素后細胞活力有所增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 ROS水平、LDH活性

與對照組相比,經(jīng)過LPS/ATP處理后細胞內(nèi)ROS水平、LDH活性明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與LPS/ATP組相比較,經(jīng)過EMO處理后的細胞內(nèi)ROS水平、LDH活性下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。

與0 μmol/L相比較,#P<0.05;與60 μmol/L相比較,*P<0.05 與對照組相比,*P<0.05;與LPS/ATP組相比,#P<0.05圖1 不同處理條件對細胞活力的影響Figure 1 The effects of different treatment conditions on cell viability

與對照組相比,*P<0.05;與LPS/ATP組相比,#P<0.05圖2 大黃素對LPS/ATP處理后細胞上清ROS、LDH水平的影響Figure 2 The effect of emodin on the levels of ROS and LDH in supernatant of cells after treated with LPS/ATP

2.3 NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平的變化

與對照組相比,經(jīng)過LPS/ATP處理后,細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與LPS/ATP培養(yǎng)細胞相比較,經(jīng)過EMO處理后的細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05;與LPS/ATP組相比,#P<0.05圖3 大黃素對LPS/ATP處理后細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白的影響Figure 3 The effects of emodin on NLRP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 proteins after LPS/ATP treatment

3 討論

本研究通過向細胞培養(yǎng)液中預先加入大黃素溶液來減輕LPS/ATP共同作用誘導的細胞焦亡,從而達到對細胞的保護作用。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白ASC和caspase-1組成[15],脂多糖(LPS)通過作用于細胞膜表面的CD14/TLR4受體來激活細胞,促進NLRP3炎性小體形成[16],從而使細胞發(fā)生炎癥反應[17];此外ATP作用于P2X7受體也可以誘發(fā)NLRP3炎癥小體的形成。在誘導焦亡的過程中,單獨給予LPS和ATP并不能引起caspase-1和IL-1β的顯著升高,而經(jīng)過LPS刺激細胞后再給予ATP,會使caspase-1和IL-1β顯著升高[18]。因為NLRP3的激活需要兩種信號的參與,第一種信號是TLR4/LPS,可以促進proIL-1β的形成;第二種信號為ATP等物質(zhì)的刺激[19]。LPS只能促進procaspase-1和proIL-1β形成,當給予ATP刺激后,會使NLRP3炎癥小體活化,進而依次活化caspase-1、IL-1β、IL-18,引起細胞焦亡。當細胞內(nèi)ROS的含量增加時,會促進NLRP3炎性小體活化,隨后大量激活caspase-1、IL-1β、IL-18,引起細胞焦亡,導致細胞損傷加重,LDH水平增加[20,21]。

大黃素為蒽醌衍生物,對機體具有多重保護作用,研究發(fā)現(xiàn),ATP通過作用于P2X7受體,使離子通道通道打開,允許陽離子(Na+、Ca2+等)通過,使胞質(zhì)中Ca2+濃度升高,進而引起細胞損傷[22]。大黃素可以作用于P2X7受體抑制ATP的作用,使胞質(zhì)中Ca2+濃度降低、減少IL-1β的釋放以及ROS的產(chǎn)生,減輕細胞損傷[23]。此外有研究表明,大黃素還可以通過多種途徑抑制LPS的作用從而減輕細胞損傷[24,25]。在LPS參與的炎癥反應中,LPS激活TLR4信號通路被認為是最重要的部分[26],TLR4活化后可以激活MyD88和TRIF,進而引起炎癥反應[27,28],進而通過髓系分化因子88[29]或TRIF相關的銜接分子[30]活化NF-κB,TLR4/MyD88/NF-κB通過活化NLRP3炎性小體,導致細胞焦亡的發(fā)生[31]。此外,研究發(fā)現(xiàn),TLR信號通路和氧化應激可以相互作用,ROS可以促進TLR4的表達[32],而TLR4還可以通過MyD88促進ROS產(chǎn)生[33,34],繼而促進NLRP3炎性小體活化,導致焦亡的發(fā)生發(fā)展[35]。大黃素可以通過抑制TLR4/NF-κB或者促進Nrf2來抑制ROS產(chǎn)生,進而抑制炎癥反應發(fā)生[11,36],減輕細胞焦亡。

本研究結(jié)果表明,與對照組相比,經(jīng)過LPS/ATP處理后,細胞的ROS產(chǎn)生增加,同時生成pro-caspase-1和pro-IL-1β,ROS刺激NLRP3炎性小體,促進pro-caspase-1成熟為caspase-1,活化的caspase-1促進pro-IL-1β成熟,引起細胞焦亡。當向細胞培養(yǎng)液中加入大黃素后,能夠抑制ROS產(chǎn)生,減少NLRP3炎性小體活化,減少caspase-1、IL-1β、IL-18和LDH產(chǎn)生,減少細胞焦亡,減少細胞損傷。

綜上所述,本研究結(jié)果證實,大黃素可以通過抑制細胞ROS的產(chǎn)生,進而抑制NLRP3炎性小體和caspase-1通路活化,減少焦亡發(fā)生。大黃素的保護作用可能不僅與抑制ROS的釋放有關,而且可能通過多條信號通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果提示,大黃素對血管內(nèi)皮細胞有保護作用,通過這種保護作用可以減少細胞損傷,從而發(fā)揮其對心血管疾病的防治作用。