吳仲恒,王 濤,惠艷娉,李立博,張巧俊*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,西安 710004;2西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系;*通訊作者,E-mail:zhangqj@mail.xjtu.edu.cn)

邊緣前皮質(zhì)(prelimbic cortex,PrL)是內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex,mPFC)腹側(cè)部的重要組成部分,主要參與情感、認(rèn)知和記憶等功能活動的調(diào)節(jié)[1]。PrL是參與條件反射恐懼消除和焦慮行為調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)[2]。α1腎上腺素受體在與焦慮等情感行為調(diào)節(jié)相關(guān)的邊緣葉腦區(qū)中有豐富表達(dá),如mPFC、杏仁核和海馬等[3]。早期研究證實,體循環(huán)給予α1腎上腺素受體激動劑可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮樣反應(yīng),而α1腎上腺素受體拮抗劑則發(fā)揮抗焦慮樣作用[4]。既往的研究還顯示α1腎上腺素受體拮抗劑哌唑嗪可以阻斷西酞普蘭的抗焦慮作用[5]和大麻素受體拮抗劑AM251的致焦慮作用[6]。以上研究結(jié)果提示α1腎上腺素受體的激活或阻斷在焦慮相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種以運動遲緩、肌強(qiáng)直和靜止性震顫等運動系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,此外,還具有一系列非運動系統(tǒng)癥狀(non-motor symptoms,NMS)如焦慮、抑郁和認(rèn)知障礙等。這些NMS甚至早于運動癥狀出現(xiàn)并持續(xù)存在[7]，且和健康相關(guān)生活質(zhì)量下降有關(guān)[8]。PD患者中焦慮和抑郁障礙常伴發(fā),經(jīng)治療后抑郁癥狀改善,但大多數(shù)情況下焦慮仍存在[9],如何治療PD相關(guān)焦慮障礙成為近年來關(guān)注的熱點。PD主要的病理改變?yōu)楹谫|(zhì)-紋狀體多巴胺(dopamine,DA)通路損害,但DA通路損害往往伴有去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)等其他神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能紊亂。因此,激活或阻斷PrL內(nèi)α1腎上腺素受體可能通過調(diào)節(jié)PrL及相關(guān)邊緣腦區(qū)的神經(jīng)活動影響PD焦慮樣行為,而目前并未見研究探討PrL內(nèi)α1腎上腺素受體對PD焦慮障礙的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。本研究以6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)損毀的PD模型大鼠為對象,采用高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗,觀察6-OHDA單側(cè)損毀內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle,MFB)后對大鼠焦慮樣的行為影響,觀察激活或阻斷PrL中α1腎上腺素受體對大鼠焦慮樣的行為影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗選用健康成年雄性SD大鼠(SPF級,6-8周齡)共156只,體質(zhì)量240-330 g,由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供,動物許可證號:SCXK(陜)2012-003。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),12 h晝/夜循環(huán),室溫(22 ± 2)℃,并自由飲水、攝食。實驗過程最大限度減少動物用量和減輕動物的痛苦。

1.2 主要試劑與儀器

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、阿樸嗎啡(apomorphine,APO)、鹽酸苯腎上腺素(phenylephrine hydrochloride,選擇性α1腎上腺素受體激動劑)和鹽酸苯那沙坦(benoxathian hydrochloride,選擇性α1腎上腺素受體拮抗劑)等購自美國Sigma公司。6-OHDA和APO均溶解于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中,鹽酸苯腎上腺素和鹽酸苯那沙坦均溶解于生理鹽水中,所有藥物均于實驗當(dāng)天配制。腦立體定位儀(SN-2N)和微電極推進(jìn)器(SM-21)購自于日本Narishige公司、冰凍切片機(jī)購自于美國Thermo-Scientific公司,牙科電鉆(PK-500)購自于中國臺灣寶工實業(yè)股份有限公司、數(shù)碼攝像機(jī)(HR-550E)購自于日本Olympus公司等。

1.3 實驗分組和大鼠帕金森病模型的建立

1.3.1 實驗分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組和PD模型組,每組78只,為進(jìn)一步評測MFB損毀或PrL內(nèi)注射α1腎上腺素受體激動劑或拮抗劑對大鼠行為學(xué)的影響,兩組大鼠均分4個亞組進(jìn)行分析(n=8-10):①生理鹽水/生理鹽水組:先注射生理鹽水0.5 μl作為前對照,然后注射生理鹽水0.5 μl作為溶媒組;②生理鹽水/苯腎上腺素組:先注射生理鹽水0.5 μl(溶媒)作前對照,然后注射苯腎上腺素0.5 μl(α1腎上腺素受體激動劑);③生理鹽水/苯那沙坦組:先注射生理鹽水0.5 μl(溶媒)作前對照,然后注射苯那沙坦0.5 μl(α1腎上腺素受體拮抗劑);④苯那沙坦/苯腎上腺素組:先注射苯那沙坦0.5 μl(α1腎上腺素受體拮抗劑)作前對照,然后注射苯腎上腺素0.5 μl(α1腎上腺素受體激動劑)。

1.3.2 大鼠帕金森病模型的建立 采用右側(cè)MFB注射6-OHDA建立單側(cè)完全損毀的PD大鼠模型。腹腔注射4%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上。根據(jù)Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)MFB位置(AP 4.4 mm,ML 1.2 mm,DV 7.8 mm距硬腦膜)[10]。利用牙科電鉆在定位點轉(zhuǎn)孔,直徑約2 mm,暴露腦表面。在轉(zhuǎn)孔上方固定充灌6-OHDA(12 μg/4 μl)溶液的10 μl微量注射器,注射器前端粘有玻璃微電極,利用微電極推進(jìn)器緩慢進(jìn)針,到達(dá)注射部位后按0.5 μl/min緩慢注射,注射完畢后留針5 min,然后緩慢退針,縫合皮膚,再次消毒手術(shù)部位皮膚。以同樣方式,在假手術(shù)組大鼠僅注射4 μl生理鹽水作為對照。

外科手術(shù)后1周,采用APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實驗評估6-OHDA損毀是否成功。大鼠頸部皮下注射APO(0.05 mg/kg),藥物注射后15 min內(nèi)如果大鼠出現(xiàn)向6-OHDA損毀MFB對側(cè)的持續(xù)旋轉(zhuǎn)行為,且5 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于20圈以上則判定為合格的PD模型,可用于進(jìn)一步的實驗[11]。

1.4 導(dǎo)向套管的埋置和PrL內(nèi)藥物注射

1.4.1 導(dǎo)向套管的埋置 參考Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)PrL位置(AP 3.3 mm,ML 0.7 mm,DV 2.0 mm距硬腦膜)[10]。利用牙科電鉆在PrL顱骨表面定位標(biāo)記點鉆直徑約2 mm的小孔,暴露腦表面。用螺絲刀在定位小孔周圍擰緊消毒的3-4枚小螺絲。將不銹鋼套管固定在夾持器上,定位在PrL定位孔上方,利用微量推進(jìn)器將套管緩慢推進(jìn)至PrL上方1 mm處,然后用牙科水泥均勻涂抹固定套管和螺絲。待牙科水泥冷卻凝固后,小心移除夾持器,并向不銹鋼套管內(nèi)插入不銹鋼內(nèi)芯,防止后期套管因出血、滲出或異物堵塞。大鼠在套管埋置手術(shù)完成后恢復(fù)1周。

1.4.2 PrL內(nèi)藥物注射 行為學(xué)檢測前10 min,拔出套管內(nèi)芯,首先把與1 μl微量注射器連接的PE-10導(dǎo)管插入預(yù)先埋置的導(dǎo)向套管,導(dǎo)管尖端達(dá)套管末端下1 mm處,然后向兩組大鼠右側(cè)PrL內(nèi)分別注射以下藥物:生理鹽水(劑量0.5 μl)、鹽酸苯腎上腺素(劑量0.5 μl,濃度20 g/L)和鹽酸苯那沙坦(劑量0.5 μl,濃度10 g/L)。為避免溶媒(生理鹽水)對行為學(xué)結(jié)果影響,生理鹽水/生理鹽水、生理鹽水/苯腎上腺素、生理鹽水/苯那沙坦組大鼠,先向PrL內(nèi)注射0.5 μl生理鹽水,停留5 min,再向PrL內(nèi)分別注射生理鹽水(劑量0.5 μl)、鹽酸苯腎上腺素(劑量0.5 μl,濃度20 g/L)和鹽酸苯那沙坦(劑量0.5 μl,濃度10 g/L)。對于需要聯(lián)合注射藥物(苯那沙坦/苯腎上腺素組)的大鼠,先向PrL內(nèi)注射鹽酸苯那沙坦(劑量0.5 μl,濃度10 g/L),注射完畢,停留5 min,再向PrL注射鹽酸苯腎上腺素(劑量0.5 μl,濃度20 g/L)。所用藥物劑量基于大鼠在體實驗研究報道及預(yù)實驗結(jié)果[12,13]。

1.5 行為學(xué)實驗

所有行為學(xué)實驗均在MFB內(nèi)注射生理鹽水或6-OHDA后第4周內(nèi)進(jìn)行。測試時間定于上午9 ∶00-12 ∶00間進(jìn)行,檢測地點選擇在一間隔音的房間中進(jìn)行。整個過程用HR-550E數(shù)碼相機(jī)記錄,結(jié)果由兩名不了解實驗分組情況的觀察人員進(jìn)行分析。

1.5.1 曠場實驗 曠場實驗主要用來評估PrL內(nèi)注射藥物或MFB損毀對大鼠自發(fā)運動能力的影響[14]。曠場裝置由黑色有機(jī)玻璃圍成規(guī)格為100 cm×100 cm×40 cm的結(jié)構(gòu),底及側(cè)壁為白色,底部由黑色線條劃分處25個20 cm×20 cm的方格。每只大鼠均先放置在曠場中心部位,然后觀察記錄大鼠穿格次數(shù)(squares crossed,水平運動)和站立次數(shù)(rearings,垂直活動)。

1.5.2 EPM實驗 EPM實驗主要用于評估大鼠的焦慮樣行為[15]。迷宮由兩條相對開放臂(50 cm×10 cm)和兩條相對閉合臂(50 cm×10 cm×40 cm)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)連接而成,迷宮放置于距離地面50 cm高處。將大鼠從中央格面向開放臂放入迷宮,記錄5 min內(nèi)的活動情況。出入臂定義為大鼠四肢全部出臂或入臂。計算大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)和在開放臂停留的時間分別占總次數(shù)(開放臂和閉合臂次數(shù)之和)和總時間(在兩臂停留時間之和)的百分比。其他觀察指標(biāo)還包括探頭(head-dipping)行為:指開放臂中把頭伸出并向下探究行為,次數(shù)減少提示大鼠緊張度增加,具有焦慮樣行為特征;前伸(stretched-forward)行為:指一種探究姿勢,身體前伸而后回縮到起初的位置沒有向前發(fā)生前移,前伸行為和探頭行為作用正好相反?？菇箲]作用表現(xiàn)為大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比和在開臂停留時間百分比均增加,而致焦慮作用正好相反。實驗完成后將大鼠取出,將開放臂和閉合臂內(nèi)清理干凈,噴灑酒精除去氣味,測試下一只動物。

1.6 組織學(xué)與免疫組織化學(xué)

行為學(xué)實驗完成后,采用4%水合氯醛(600 mg/kg,腹腔注射)對大鼠進(jìn)行深度麻醉,然后應(yīng)用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)150 ml快速心臟灌注,序貫4%多聚甲醛250 ml進(jìn)行固定。斷頭,剝離腦組織,將剝離好的腦組織置于4%多聚甲醛后固定4 h,然后轉(zhuǎn)移至含30%蔗糖溶液中直至沉底。在恒冷切片機(jī)上行連續(xù)冠狀冰凍切片,片厚30 μm,收集包含PrL結(jié)構(gòu)的組織切片行尼式染色,用于觀察PrL基本結(jié)構(gòu)、確定套管埋置位置。對包含黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta,SNc)和腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)的組織切片行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫組織化學(xué)染色,用于觀察DA神經(jīng)元的變性丟失程度評估MFB損毀情況。TH染色后對SNc及VTA中DA能神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù),每只大鼠選取三張切片進(jìn)行計數(shù)然后算平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PrL內(nèi)的導(dǎo)向套管埋置及藥物注射位點

圖1顯示大鼠PrL內(nèi)用于藥物注射的導(dǎo)向套管路徑及藥物注射位點,左側(cè)為尼氏染色,右側(cè)是相應(yīng)切面模式圖。

左側(cè)尼氏染色照片示大鼠PrL內(nèi)局部注射的位置(箭頭所示);右側(cè)為大鼠腦立體定位圖譜顯示PrL的冠狀切面模式圖(前囟+3.24 mm)引自文獻(xiàn)[10]圖1 PrL內(nèi)用于藥物注射位點Figure 1 The injection site of PrL

2.2 SNc和VTA區(qū)TH陽性神經(jīng)元計數(shù)

在假手術(shù)組大鼠,與未注射側(cè)相比,生理鹽水注射側(cè)內(nèi)SNc和VTA區(qū)TH陽性神經(jīng)元計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2A)。在模型組大鼠,與未注射側(cè)相比,6-OHDA注射側(cè)VTA中的TH陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著下降至(32±1)%(n=8,P<0.001,見圖2B),而SNc中的TH陽性神經(jīng)元幾乎完全丟失。

左側(cè):注射側(cè),右側(cè):未注射側(cè);模型組大鼠注射側(cè)SNc中的DA神經(jīng)元完全丟失,VTA中的DA神經(jīng)元部分丟失;MTN,medial terminal nucleus of the accessory optic tract,內(nèi)側(cè)終核;圖中豎黑線代表外側(cè)的VTA與內(nèi)側(cè)白質(zhì)纖維束的分界線圖2 SNc和VTA的TH免疫組織化學(xué)染色 ( ×40)Figure 2 TH immunohistochemical staining in the SNc and VTA ( ×40)

2.3 MFB損毀及PrL內(nèi)α1腎上腺素受體激活和阻斷對大鼠自發(fā)運動能力的影響

曠場實驗中,我們檢測了單側(cè)6-OHDA損毀MFB以及PrL內(nèi)分別注射生理鹽水、苯腎上腺素、苯那沙坦和苯那沙坦/苯腎上腺素對大鼠水平和垂直運動能力的影響。結(jié)果顯示,MFB損毀引起大鼠水平運動(穿格次數(shù),F1,64=184.218,P<0.001,見圖3A)和垂直運動(直立次數(shù),F1,64=53.439,P<0.001,見圖3B)能力顯著下降。不論假手術(shù)組還是模型組大鼠,與PrL內(nèi)注射生理鹽水相比,PrL內(nèi)注射苯腎上腺素、苯那沙坦和苯那沙坦/苯腎上腺素均未能影響大鼠的水平和垂直運動能力(見圖3)。

與假手術(shù)組比較,* * *P<0.001圖3 MFB損毀、激活或阻斷PrL內(nèi)α1腎上腺素受體對大鼠自發(fā)運動能力的影響 (n=8)Figure 3 Changes of spontaneous locomotor activity after MFB lesion, activation or blockade of α1-adrenoceptors in the PrL (n=8)

2.4 MFB損毀及PrL內(nèi)α1腎上腺素受體激活和阻斷對大鼠焦慮樣行為的影響

在EPM實驗中,采用6-OHDA單側(cè)損毀MFB,通過導(dǎo)向套管向PrL內(nèi)注射苯腎上腺素、苯那沙坦以及給予苯那沙坦/苯腎上腺素等藥物后觀察大鼠在開放臂停留時間百分比和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比的變化情況。雙因素方差分析(損毀×藥物)顯示損毀因素(開放臂停留時間百分比,F1,76=16.137,P<0.001;開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比,F1,76=18.820,P<0.001)和藥物因素(開放臂停留時間百分比,F3,76=13.139,P<0.001;開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比,F3,76=16.380,P<0.001)均能對大鼠的開放臂停留時間百分比和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比產(chǎn)生了顯著影響(見圖4)。進(jìn)一步分析顯示,與局部注射生理鹽水相比,PrL內(nèi)注射苯腎上腺素顯著降低了假手術(shù)組大鼠在開放臂停留時間百分比和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比(P<0.01,見圖4A和B),表明誘導(dǎo)焦慮樣反應(yīng);而對模型組大鼠,PrL內(nèi)注射苯腎上腺素對開放臂停留時間和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比的影響無顯著性差異。與苯腎上腺素作用相比,苯那沙坦顯著增加假手術(shù)組大鼠在開放臂停留時間的百分比(P<0.05,見圖4A)和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比(P<0.01,見圖4B),表明抗焦慮樣反應(yīng);對模型組大鼠,PrL內(nèi)注射苯那沙坦對開放臂停留時間和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比影響無顯著性差異。假手術(shù)組大鼠預(yù)先給予苯那沙坦可以阻斷苯腎上腺素的效應(yīng)(P<0.05,見圖4A)。

在EPM中,采用6-OHDA單側(cè)損毀MFB,通過導(dǎo)向套管向PrL內(nèi)注射苯腎上腺素、苯那沙坦以及給予苯那沙坦/苯腎上腺素等藥物后觀察大鼠探頭和前伸次數(shù)的變化。雙因素方差分析(損毀×藥物)顯示損毀因素(探頭次數(shù),F1,76=35.775,P<0.001;前伸次數(shù),F1,76=21.074,P<0.001)和藥物因素(探頭次數(shù),F3,76=33.469,P<0.001;前伸次數(shù),F3,76=30.706,P<0.001)均能對大鼠的探頭和前伸次數(shù)產(chǎn)生顯著影響(見圖4C，D)。進(jìn)一步分析顯示,與局部注射生理鹽水相比,PrL內(nèi)注射苯腎上腺素顯著降低假手術(shù)組和模型組大鼠探頭次數(shù)(假手術(shù)組:P<0.001;模型組:P<0.05,見圖4C)和增加前伸次數(shù)(假手術(shù)組:P<0.01;模型組:P<0.001,見圖4D),表明誘導(dǎo)焦慮樣反應(yīng)。與苯腎上腺素作用相比,苯那沙坦顯著增加假手術(shù)組大鼠和模型組大鼠探頭次數(shù)(假手術(shù)組:P<0.001;模型組:P<0.05,見圖4C)和降低前伸次數(shù)(假手術(shù)組:P<0.05;模型組:P<0.01,見圖4D),表明抗焦慮樣反應(yīng)。假手術(shù)組大鼠預(yù)先給予苯那沙坦可以阻斷苯腎上腺素的效應(yīng)(探頭次數(shù):P<0.001;前伸次數(shù):P<0.05,見圖4C)。模型組大鼠預(yù)先給予苯那沙坦亦可以阻斷苯腎上腺素的效應(yīng)(探頭次數(shù):P<0.05;前伸次數(shù):P<0.01,見圖4D)。

與假手術(shù)組比較,* * *P<0.001;與同組內(nèi)注射生理鹽水/生理鹽水比較,#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001;與同組內(nèi)注射生理鹽水/苯腎上腺素比較,&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001MFB損毀后大鼠在開放臂停留時間百分比、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和探頭次數(shù)顯著下降,而前伸次數(shù)明顯增加。在假手術(shù)組,PrL內(nèi)注射苯腎上腺素減少大鼠在開放臂停留時間百分比、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和探頭次數(shù),且增加前伸次數(shù);苯那沙坦可增加大鼠在開放臂停留時間百分比、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和探頭次數(shù),且減少前伸次數(shù);預(yù)先注射苯那沙坦可阻斷苯腎上腺素效應(yīng)。在模型組,PrL內(nèi)注射苯腎上腺素可以減少探頭次數(shù)和增加前伸次數(shù),而苯那沙坦可增加探頭次數(shù)和減少前伸次數(shù);預(yù)先注射苯那沙坦可阻斷苯腎上腺素的效應(yīng)圖4 MFB損毀、激活或阻斷PrL內(nèi)α1腎上腺素受體對大鼠焦慮樣行為的影響 (n=8-10)Figure 4 Effects of MFB lesion, activation or blockade of α1-adrenoceptors in the PrL on anxiety-like behaviors (n=8-10)

3 討論

曠場實驗是常用的用于評估大鼠等動物自發(fā)運動能力的方法[14,15]。本研究中,單側(cè)損毀MFB后大鼠在曠場中水平跨格數(shù)和垂直站立次數(shù)明顯下降,這與之前的研究結(jié)果一致[16,17],提示黑質(zhì)-紋狀體DA通路損毀后導(dǎo)致大鼠自發(fā)運動能力的下降此外,本研究還證實PrL局部注射α1腎上腺素受體激動劑苯腎上腺素和拮抗劑苯那沙坦后對大鼠自發(fā)運動能力沒有顯著的影響,表明苯腎上腺素和苯那沙坦在焦慮行為檢測中所產(chǎn)生的效應(yīng)與大鼠的運動能力無直接聯(lián)系,排除了運動能力行為評測的干擾。

焦慮是PD患者中最常見的NMS癥狀之一,但PD模型大鼠中是否也存在類似于人類的焦慮樣的行為,目前研究尚未獲得一致的結(jié)論。一些研究發(fā)現(xiàn)PD模型大鼠在曠場實驗、EPM以及社會干預(yù)等行為學(xué)實驗中具有焦慮樣的行為[18,19],而另一些研究則得出不同的結(jié)論,PD模型大鼠在上述行為學(xué)實驗中未能顯示出焦慮樣行為特征[20,21]。出現(xiàn)以上分歧的可能原因如下:6-OHDA損毀的部位如MFB、SNc或紋狀體的不同、是完全或部分損毀的程度的不同、單側(cè)或雙側(cè)損毀的側(cè)別不同、行為學(xué)測試方法差異等。本研究中,與假手術(shù)組大鼠相比,MFB損毀后大鼠在EPM中的開放臂停留時間和進(jìn)入次數(shù)百分比的降低和探頭行為次數(shù)下降及前伸行為次數(shù)增加等,均提示損毀MFB可以誘發(fā)大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,不僅在傳統(tǒng)的反映時-空特征的焦慮樣行為而且在反映緊張度相關(guān)的焦慮行為中均有明顯的差異,本結(jié)果部分指標(biāo)與本課題組前期結(jié)果相符[14,16,22],而反映大鼠緊張度相關(guān)的焦慮樣行為的改變?yōu)槭状巫C實,對進(jìn)一步研究PD動物模型的焦慮行為改變具有重要的意義。

研究證據(jù)顯示PrL作為mPFC亞區(qū)之一,是調(diào)節(jié)大鼠焦慮行為的重要腦區(qū)結(jié)構(gòu)[23,24]。許多神經(jīng)精神類疾病如焦慮與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高水平NA的轉(zhuǎn)換有關(guān)[25],且伴有mPFC功能失調(diào)[26]。研究還顯示當(dāng)暴露于應(yīng)激條件下,mPFC存在高水平的NA釋放并刺激α1腎上腺素受體而損害PFC的功能[27],而PFC中有豐富的α1腎上腺素受體表達(dá)[28]。早期研究發(fā)現(xiàn):在“X”迷宮實驗中,體循環(huán)應(yīng)用α1腎上腺素受體激動劑(苯腎上腺素和ST587)可產(chǎn)生焦慮樣行為,而阻斷α1腎上腺素受體(哌唑嗪和百里胺)可產(chǎn)生抗焦慮樣反應(yīng)[4]。也有研究顯示,通過向大鼠杏仁中央核內(nèi)雙側(cè)微量注射α1腎上腺素受體拮抗劑苯那沙坦后,在社會干預(yù)(social interaction,SI)實驗中可以以劑量依賴的模式阻斷了SI時間的下降,表明具有抗焦慮作用[12]。但也有研究者得出不同的結(jié)論,NAc殼部內(nèi)微量注射α1腎上腺素受體激動劑苯腎上腺素后并未改變EPM實驗中開放臂停留時間及開放臂進(jìn)入次數(shù)等與焦慮樣行為相關(guān)的參數(shù)[13]。然而,目前還沒有關(guān)于激活或阻斷PrL內(nèi)α1腎上腺素受體后對于焦慮影響的研究數(shù)據(jù),尤其是與PD相關(guān)的焦慮。本研究中,在假手術(shù)組PrL內(nèi)局部注射苯腎上腺素方法可降低EPM實驗中開放臂停留時間百分比、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和探頭行為次數(shù)以及增加前伸行為次數(shù)等,研究結(jié)果提示:激活PrL內(nèi)α1腎上腺素受體激活后產(chǎn)生了焦慮樣效應(yīng),而阻斷α1腎上腺素受體誘發(fā)產(chǎn)生抗焦慮樣反應(yīng)。此外,與假手術(shù)組大鼠相比,單側(cè)MFB損毀制備的PD模型大鼠,局部注射苯腎上腺素后并未改變EPM中開放臂停留時間百分比、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比等反映焦慮行為時-空特性參數(shù),卻改變了與緊張度相關(guān)的探頭和前伸行為。分析原因可能與行為學(xué)評價方法的不同有關(guān),目前還沒有一種動物模型可以完美地模擬人類的焦慮行為,每種動物模型都具備各自的特點,這一點在以往的一些研究中也可以獲得佐證:一項研究顯示激活終紋床核的α1腎上腺素受體可以易化EPM中焦慮樣行為但卻沒有改變SI中的焦慮行為,而另一項研究顯示α1腎上腺素受體拮抗劑作用于杏仁中央核可以降低SI中焦慮反應(yīng)而對EPM的焦慮行為沒有影響,結(jié)果提示兩種不同的行為學(xué)測試方法對于焦慮特性的反應(yīng)具有兩種不同維度[12]。其他可能的因素還包括MFB損毀后大鼠運動能力下降在某些焦慮評價模型中對焦慮樣行為影響、藥物注射是選擇體循環(huán)給藥還是局部給藥方式的不同、激動劑或拮抗劑選擇性不同等。

大量臨床和動物實驗研究證實黑質(zhì)-紋狀體通路變性導(dǎo)致了NA遞質(zhì)系統(tǒng)的變化,而NA遞質(zhì)系統(tǒng)的功能紊亂可以直接導(dǎo)致焦慮的發(fā)生。PrL接受來自LC的NA能纖維投射且表達(dá)豐富的α1腎上腺素受體[29]。本課題前期的研究已經(jīng)證實PrL局部注射α1腎上腺素受體激動劑苯腎上腺素后,可興奮PrL中的Glu能神經(jīng)元的活動[15],而Glu神經(jīng)元過度活動與焦慮障礙有關(guān),過度活動的PrL內(nèi)Glu神經(jīng)元是投射神經(jīng)元,發(fā)出纖維支配邊緣系統(tǒng)中主要包括杏仁核在內(nèi)的許多核團(tuán),進(jìn)一步可引起杏仁核等相關(guān)核團(tuán)單胺類遞質(zhì)的改變,最終調(diào)節(jié)焦慮行為的發(fā)生,表現(xiàn)為誘導(dǎo)焦慮的產(chǎn)生或焦慮樣行為的增強(qiáng)。

本實驗的主要研究結(jié)果證實:①6-OHDA單側(cè)損毀MFB后導(dǎo)致大鼠自發(fā)運動能力下降,并可誘發(fā)大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為;②在假手術(shù)組及模型組大鼠,PrL局部給予α1腎上腺素受體激動劑苯腎上腺素可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,而α1腎上腺素受體拮抗劑苯那沙坦產(chǎn)生了抗焦慮樣效應(yīng),且兩種藥物對大鼠自發(fā)運動能力均沒有影響。特別指出的是,不同于假手術(shù)組大鼠,模型組大鼠在藥物干預(yù)后在EPM中反映常見的時-空特性的焦慮行為并未發(fā)生改變,僅是與緊張度密切相關(guān)的焦慮行為存在顯著性差異。

綜上所述,本研究結(jié)果證實了PrL在調(diào)節(jié)焦慮行為中的重要作用,闡明了PrL中α1腎上腺素受體參與了PD焦慮行為調(diào)節(jié),為PD焦慮的治療提供了新的靶點。