李博濤,項(xiàng) 羽,崔倩衛(wèi),王軍奎,趙 娜*

(1西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科,西安 710068;2西安醫(yī)學(xué)院附屬陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:dr.zhaona@qq.com)

心臟纖維化是心臟重塑的重要病理過程之一,同時也是促進(jìn)心肌舒張及收縮功能減弱,導(dǎo)致心力衰竭的心血管終末病理生理狀態(tài)發(fā)生的重要原因之一[1]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosteron system,RAAS)調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理生理過程之一。大量研究顯示RAAS系統(tǒng)過度激活能促進(jìn)以膠原成分為主的細(xì)胞外基質(zhì)聚積于心臟間質(zhì),最終發(fā)生心臟纖維化[2]。因此,抑制RAAS系統(tǒng)過度激活是抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積,從而預(yù)防和治療心力衰竭的關(guān)鍵過程之一。迄今為止,大量臨床研究證據(jù)明確RAAS系統(tǒng)抑制劑—血管緊張素酶轉(zhuǎn)換劑及血管緊張素-2受體阻滯劑能發(fā)揮抑制心臟纖維化作用[3]。

替米沙坦是一種新型長效高選擇性血管緊張素2受體1型阻滯劑,目前在臨床中被廣泛應(yīng)用于高血壓病的治療。除此之外,一部分臨床試驗(yàn)證實(shí)替米沙坦具有不依賴于其降壓效應(yīng)的心臟保護(hù)作用[4],如能抑制高血壓誘導(dǎo)心臟重塑[5],擴(kuò)張型心肌病心臟重塑[6]及心肌梗死心臟重塑[7]中的膠原沉積,發(fā)揮抗纖維化作用。

替米沙坦抗心臟纖維化作用的具體分子機(jī)制多種多樣,多數(shù)與其阻斷血管緊張素受體相關(guān),然而目前少量研究也已表明存在替米沙坦發(fā)揮抑制纖維化作用不依賴于血管緊張素受體的證據(jù)[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦不直接以TGF-β1/Smad信號通路為靶點(diǎn)在RAAS系統(tǒng)過度激活作用下發(fā)揮抗心臟纖維化作用[9],本研究旨在進(jìn)一步探討替米沙坦發(fā)揮抑制RAAS系統(tǒng)激活下的心臟纖維化的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理

將40只4周齡雄性SD大鼠(SPF級,西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心),體質(zhì)量(112.44 ± 7.62)g,隨機(jī)分為四組,每組10只,分別為對照組(Vehicle/Veh)、血管緊張素……組(Ang ……)、血管緊張素……+替米沙坦組(Ang ……+Telm)和替米沙坦組(Telm)。采用外科手術(shù)方式為大鼠皮下植入Alzet滲透壓緩釋泵(Durect公司,美國)[10],每天泵入生理鹽水(Veh),或0.8 mg/kg Ang ……,持續(xù)4周分別制作對照組及心肌纖維化模型組(Ang ……)。利用天狼猩紅染色評價心肌纖維化模型是否成功。造模成功后,在Ang ……組基礎(chǔ)上采用灌胃法使用替米沙坦溶液處理大鼠,劑量為10 mg/(kg · d),灌胃液體積2.5 ml/100 g,共連續(xù)處理2周制作血管緊張素……+替米沙坦組(Ang ……+Telm)。在對照組基礎(chǔ)上采用灌胃方法處理替米沙坦,劑量為10 mg/(kg · d),灌胃液體積2.5 ml/100 g建立替米沙坦組(Telm)。

1.2 心臟超聲檢測

采用Vevo770 ultrasound system(Visual Sonics Inc,加拿大)小動物超聲儀對大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行無創(chuàng)性評價(探頭頻率17.5 MHz,探測深度2 cm,掃描速度100 mm/s)。超聲探頭置于大鼠胸骨前,二維超聲清晰顯示左室短軸切面,于乳頭肌水平應(yīng)用M型超聲記錄左心室運(yùn)動曲線,測量舒張末期左室內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic inner-dimension,LVIDd)、收縮末期左室內(nèi)徑(left ventricular end-systolic inner-dimension,LVIDs),計(jì)算左室短軸縮短率(fraction shortening,FS)。FS%=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%。

1.3 血流動力學(xué)檢測

采用頸動脈心室內(nèi)插管法評估各組大鼠心臟血流動力學(xué)指標(biāo)。10%水合氯醛腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉,解剖右側(cè)頸外動脈,插管后連接壓力換能器采集生物信號,啟動生物信息采集系統(tǒng)(AD Instrument)生物壓力檢測模塊,檢測左室收縮壓(LVSP)以及左室舒張末壓(LVEDP)。

1.4 天狼猩紅染色評價膠原沉積

分離部分心室肌組織,置于4%多聚甲醛后,經(jīng)進(jìn)一步脫水,石蠟包埋后,進(jìn)行天狼猩紅染色(Leagene公司)觀察心臟間質(zhì)纖維化。膠原組織呈現(xiàn)天狼猩紅色,纖維化面積占總心室肌面積采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0處理計(jì)算。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法評估大鼠心肌組織PPARγ/NF-κB信號通路活化情況

處死大鼠后收集心室肌標(biāo)本,RIPA裂解液(Santa Cruz公司)勻漿、離心后獲得心室肌組織總蛋白。心肌組織細(xì)胞核蛋白提取按照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行操作(ThermoFish公司)。稱取25 mg心肌組織,剪碎后,加入胞質(zhì)提取試劑Ⅰ 250 L后勻漿,將勻漿轉(zhuǎn)入EP管中,渦旋震蕩15 s后,冰孵10 min;隨后加入13.75 L胞質(zhì)提取試劑……,渦旋震蕩5 s后冰孵1 min。再次渦旋震蕩5 s后,16 000g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移另一預(yù)冷EP管。進(jìn)一步渦旋上清中未完全溶解部分,加入100 L冰細(xì)胞核提取試劑,渦旋震蕩3次,每次15 s,冰上靜置10 min,隨后16 000g離心10 min,取上清液即獲得細(xì)胞核蛋白。蛋白濃度定量采用BCA蛋白定量法?？偟鞍谆蚝说鞍讟悠窇?yīng)用100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h,總蛋白樣品分別加入PPARγ(Santa Cruz公司)、NF-κB(Abcam公司)、GAPDH(Abcam公司);核蛋白樣品分別加入NF-κB(Abcam公司)及Lamin B(BOSTER公司)抗體,分別在4 ℃下孵育12 h。PBST洗滌后進(jìn)行洗膜,室溫下,采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法使條帶顯影,顯影圖像利用吸光度法定量,GAPDH及Lamin B蛋白水平用作內(nèi)參校正蛋白。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光共聚焦顯微鏡

參考文獻(xiàn)[11]方法分離培養(yǎng)乳大鼠心臟成纖維細(xì)胞,待細(xì)胞融合至80%,更換無血清培養(yǎng)基,24 h后,給予血管緊張素……(0.1 mol)處理預(yù)孵育1 h,或與替米沙坦(10 nmol)共孵育24 h。隨后去除上清液,在4%多聚甲醛中固定15 min,由含有0.5%的Triton X-100 PBS滲透化處理15 min。洗滌封閉后,與NF-κB抗體孵育3 h。洗滌后,與FITC標(biāo)記的二抗室溫下孵育60 min。應(yīng)用Hoechst 33342復(fù)染細(xì)胞核。應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微鏡(Olympus FV1000)獲取圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦處理對心肌纖維化大鼠心功能的影響

與Veh組相比,Ang ……組大鼠FS顯著下降(P<0.05);與Ang ……組大鼠相比,Ang ……+Telm組大鼠FS顯著增加(P<0.05,見圖1)。與Veh組相比,Ang ……組大鼠LVSP顯著降低(P<0.05),同時LVEDP水平顯著升高(P<0.05);與Ang ……大鼠相比,Ang ……+Telm大鼠LVSP顯著增加(P<0.05),LVEDP顯著下降(P<0.05,見圖1)。

Veh:對照;Ang ……:血管緊張素 ……;Telm:替米沙坦;FS:短軸縮短率;LVEDP:左室舒張末壓力;LVSP:左室收縮壓;與Veh組相比,*P<0.05;與Ang ……組相比,#P<0.05圖1 各組大鼠心臟超聲短軸縮短率及心臟血流動力學(xué)指標(biāo)比較Figure 1 Comparison of fraction shortening level captured by M-mode echocardiography and hemodynamic indexes among four groups

2.2 替米沙坦處理對心肌纖維化大鼠膠原的影響

心臟組織天狼猩紅染色所示,與Veh組相比,Ang ……組心臟組織中膠原水平顯著增加(P<0.05);與Ang ……組相比,Ang ……+Telm組心臟組織內(nèi)膠原水平顯著減少(P<0.05,見圖2)。

2.3 替米沙坦處理對PPAR-γ/NF-κB信號通路的影響

與Veh組相比,Ang ……組大鼠心肌組織全細(xì)胞PPAR-γ蛋白表達(dá)降低,NF-κB蛋白表達(dá)不變,細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與Ang ……組相比,Ang ……+Telm組大鼠心臟組織全細(xì)胞PPAR-γ蛋白表達(dá)增加,NF-κB蛋白表達(dá)不變,細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.05,見圖3)。

在心臟成纖維細(xì)胞中,與Veh組相比,Ang ……組NF-κB活化入核,而Ang ……+Telm組NF-κB入核被抑制(見圖4)。

Veh:對照;Ang ……:血管緊張素 ……;Telm:替米沙坦;CVF:膠原容積比例圖2 各組心肌組織膠原蛋白天狼猩紅染色Figure 2 Sirius red staining of collagen content in four groups

Veh:對照;Ang ……:血管緊張素 ……;Telm:替米沙坦;與Veh相比,*P<0.05;與Ang ……組相比,#P<0.05圖3 各組大鼠心肌組織內(nèi)PPARγ/NF-κB信號通路激活情況Figure 3 The expression of PPARγ/NF-κB signal pathway in four groups

3 討論

心臟纖維化是各種各樣的心臟疾病,如高血壓、心肌梗死、心肌病等共同病理終點(diǎn),也是導(dǎo)致心臟衰竭的重要原因。心臟纖維化表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞(fibroblasts)增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts),肌成纖維細(xì)胞合成及分泌大量膠原蛋白,導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降,僵硬度增強(qiáng),最終發(fā)展為心臟舒張及收縮功能受損[12]。

圖4 各組心臟成纖維細(xì)胞中NF-κB活化入核比較Figure 4 The activated NF-κB in nucleis by immunofluorescence

腎素-血管緊張素……-醛固酮系統(tǒng)活化在心肌纖維化中扮演重要角色。血管緊張素……活化后通過內(nèi)皮素[13,14]、TGF-β-Smad信號通路[15]、PPARγ信號通路[16]、SP1信號通路[17]等多途徑激活心臟纖維化。近期研究顯示替米沙坦能上調(diào)PPARγ表達(dá)[18],改善胰島素抵抗。而NF-κB是PPARγ下游的重要信號分子,受到PPARγ的失活調(diào)控[19,20]。NF-κB家族包括5個成員:p65,p50,p52,RelB,c-Rel,通常以二聚體形式存在,其中p50/p65在生物體內(nèi)分布最廣泛,含量最高,生物活性也最高[21]。NF-κB異二聚體p50/p65解聚后,p65在各種因素調(diào)控下活化,活化后進(jìn)入細(xì)胞核,對下游基因發(fā)揮正向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[21]。既往研究證實(shí)NF-κB P65活化后,能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積[22],膠原組織的增加[19]。同時,PPARγ失活NF-κB p65發(fā)揮抗纖維化作用在肝纖維化[23]、肺纖維化[24]等病理過程中已被證實(shí)。而PPARγ/NF-κB信號通路是否參與血管緊張素……誘導(dǎo)的心肌纖維化尚不清楚。此外,替米沙坦是否通過PPARγ/NF-κB信號通路參與抑制心肌纖維化亦無明確證據(jù)證實(shí)。

本研究首先采用血管緊張素……誘導(dǎo)建立心臟功能不全和心肌纖維化模型,提示心肌纖維化過程參與心臟功能下降。隨后本研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素……導(dǎo)致的心肌纖維化模型中,PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯降低,初步證實(shí)PPARγ誘導(dǎo)的信號通路參與血管緊張素……誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化病理過程。此外,研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血管緊張素……誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化模型中,心臟組織中NF-κB蛋白水平不變,然而細(xì)胞核NF-κB P65蛋白水平顯著增高,且細(xì)胞水平進(jìn)一步明確血管緊張素……促進(jìn)NF-κB活化入核,而替米沙坦能抑制上述過程,證實(shí)PPARγ/NF-κB信號通路參與血管緊張素……誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化模型。

臨床中目前針對心臟重塑的治療也包括對腎素-血管緊張素……-醛固酮系統(tǒng)的抑制。替米沙坦屬于血管緊張素……受體拮抗劑,其保護(hù)腎臟[25],抑制腎纖維化[26]、肝纖維化[27]的活性均已得到研究證實(shí)及臨床應(yīng)用。本研究明確血管緊張素……誘導(dǎo)心肌纖維化模型中亦發(fā)現(xiàn)替米沙坦能發(fā)揮抗纖維化作用及改善心功能作用。然而替米沙坦發(fā)揮抗纖維化作用究竟是通過何種機(jī)制尚未完全明確,我們前期研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦在血管緊張素……誘導(dǎo)的心肌纖維化模型中發(fā)揮抗纖維化作用并不依賴于TGF-β/Smad信號通路[9,17]。本研究在血管緊張素……誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化模型中發(fā)現(xiàn)替米沙坦能發(fā)揮抗心臟纖維化,改善心功能作用,同時對其可能的分子生物學(xué)機(jī)制做一初步探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn),替米沙坦能夠上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá),并下調(diào)細(xì)胞核NF-κB P65蛋白表達(dá)。此外,在血管緊張素誘導(dǎo)的心肌纖維化的細(xì)胞模型上,替米沙坦能促進(jìn)NF-κB入核,亦進(jìn)一步證明替米沙坦通過上調(diào)PPARγ蛋白水平,進(jìn)一步使得NF-κB失活而發(fā)揮抗纖維化作用的機(jī)制。

總之,在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中,心臟纖維化在心功能的不斷惡化中扮演重要的角色。本課題發(fā)現(xiàn)替米沙坦通過減輕心肌纖維化改善心功能,并證實(shí)PPARγ/NF-κB信號通路是其作用的分子機(jī)制之一。研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充完善血管緊張素……促進(jìn)纖維化的發(fā)病機(jī)制,并為替米沙坦在心肌纖維化中的應(yīng)用增加了一定的理論基礎(chǔ)。