成利娟,楊 莉,蔣 磊,侯 梅,馬曉靜

(1安徽省第二人民醫(yī)院藥劑科,合肥 230041;2安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心,新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室;3合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院;*通訊作者,E-mail:clj20180826@126.com)

胃癌(gastric cancer)是發(fā)生在胃黏膜上皮組織的惡性腫瘤,以胃腺癌最為常見[1],在我國各類惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位[2],是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。

研究發(fā)現(xiàn)，槐糖脂主要由非致命性酵母菌產(chǎn)生,屬于糖脂類生物表面活性劑,分為酸型和內(nèi)酯型[3,4]?；碧侵蚱錈o毒、環(huán)保、生物可降解等優(yōu)點在石油工業(yè)、農(nóng)業(yè)、日化、醫(yī)藥行業(yè)展示出良好的前景[5-9]。內(nèi)酯型槐糖脂具有很好的藥物學(xué)活性,近年來,槐糖脂的抗腫瘤作用已有多篇文獻(xiàn)報道[10-14],但內(nèi)酯型槐糖脂對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的作用尚不明確。本研究初步探討了內(nèi)酯型槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞的作用及其可能的作用機制,為槐糖脂開發(fā)應(yīng)用提供相應(yīng)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫?；碧侵珊戏使I(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院馬曉靜副教授提供,純度為99.8%。DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號:C11995500BT)購于Gibco BRL公司;CCK-8(貨號:C008-3)購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司;Bax抗體(貨號:ab32503)、Bcl-2抗體(貨號:ab32124)、Caspase 9抗體(貨號:ab2324)、Caspase 3抗體(貨號:ab13847)及Cyt-c抗體(貨號:ab13575)購于Abcam公司;β-actin抗體(貨號:TA346894)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號:ZB-2301)及辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(貨號:ZB-2305)均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;胞漿蛋白提取試劑盒(貨號:P0033)、DAPI染色液(貨號:C1005)及超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號:P0018)均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

高壓蒸汽滅菌鍋(日本Tomy KOQYO公司);艾科浦超純水系統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司);CO2培養(yǎng)箱(MCO-175型,日本Sanyo);潔凈工作臺(SW-CJ-1F型,安泰);倒置顯微鏡(CK2型,日本Olympus);多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max M5,美國MD);電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(Protein Simple)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞,胰酶消化,細(xì)胞懸液按照7×103個/ml密度接種于96孔板,每孔100 μl(陰性對照組加入等體積PBS),每組設(shè)6個復(fù)孔;待細(xì)胞貼壁后,未加入槐糖脂的空白對照組換用完全培養(yǎng)基,槐糖脂作用組則加入不同濃度的槐糖脂(40,80,160,320 μg/ml)分別作用24、48 h,在倒置顯微鏡下觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài),并與空白對照組比較細(xì)胞貼壁狀態(tài),體積,折光性、碎裂等變化,并拍照。每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,在酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔吸光度值(OD值)。按以下公式計算細(xì)胞存活率:存活率( % )=(槐糖脂作用組OD值-陰性對照組OD值)/(空白對照組OD值-陰性對照組OD值)×100%。

1.2.2 熒光染色檢測細(xì)胞凋亡 將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞以每孔7×103個/ml密度接種于6孔板中,每孔分別加入2 ml新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜。實驗分為空白對照組及槐糖脂作用組,加入不同濃度的槐糖脂(40,80,160,320 μg/ml)培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基,用4 ℃預(yù)冷的PBS洗兩遍,各孔沿孔壁輕輕加入1 ml的4%多聚甲醛固定;15 min棄去多聚甲醛液,每孔加入1 ml的PBS清洗細(xì)胞,再加入DAPI染液1 ml/孔。室溫條件下避光染色10 min,棄染液,用預(yù)冷的PBS輕洗一次后立即于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位 取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞,消化收集后,以細(xì)胞懸液(7×104個/孔)接種于6孔板,2 ml/孔。實驗分為空白對照組及槐糖脂作用組,加入不同濃度的槐糖脂(40,80,160 μg/ml),在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。小心吸取培養(yǎng)液,用胰酶消化后500g/min離心5 min收集細(xì)胞后重懸于培養(yǎng)基中,每管加入羅丹明123染液1 ml,充分混勻置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃避光孵育20 min,用PBS洗滌2次,用400 μl PBS重懸后于流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 Western blot檢測Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase3及Caspase 9蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞,實驗分為空白對照組及槐糖脂作用組,加入不同濃度的槐糖脂(40，80，160 μg/ml)培養(yǎng)24 h,提取細(xì)胞總蛋白,操作如下:4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次,再加入含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液,置于冰上孵育10 min,12 000 r/min離心10 min收集上清于EP管中,加入loading buffer后100 ℃煮10 min,置于-20 ℃保存,胞質(zhì)蛋白提取采用胞質(zhì)蛋白提取試劑盒,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。使用12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,5% BSA溶液37 ℃封閉2 h;4 ℃下一抗(Bcl-2抗體、Bax抗體、Cyt-c抗體、Caspase3抗體及Caspase 9抗體,以上抗體的稀釋度均為1 ∶2 000)孵育過夜。次日,TBST每隔10 min洗膜一次,共三次;在含有HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶40 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜。最后,配制ECL試劑,曝光,分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞活力的影響

40 μg/ml槐糖脂作用SGC-7901細(xì)胞24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮,體積變小,折光性明顯下降,部分細(xì)胞漂浮,細(xì)胞貼壁狀態(tài)差,隨著作用時間的延長,細(xì)胞貼壁減少,脫落,碎裂并漂浮于培養(yǎng)液中(見圖1)?；碧侵幚砗?人胃癌SGC-7901細(xì)胞的存活率顯著降低,藥物作用24 h后IC50是155 μg/ml。作用48 h后IC50是127 μg/ml。表明槐糖脂可以抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖,該抑制作用與槐糖脂濃度成正相關(guān)且具有時間依賴性(見圖2)。

A.空白對照組 B.40 μg/ml槐糖脂組圖1 倒置顯微鏡下觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 ( ×100)Figure 1 Cell morphology after sophorolipid treatment under inverted microscope ( ×100)

與空白對照組(0 μg/ml)比較,*P<0.05,* *P<0.01圖2 不同濃度槐糖脂分別作用24 h和48 h后SGC-7901細(xì)胞存活率變化Figure 2 Survival rate of SGC-7901 after sophorolipid treatment for 24 h and 48 h

2.2 槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

空白對照組中的細(xì)胞核質(zhì)顯示出微弱暗淡的藍(lán)色,染色質(zhì)熒光表達(dá)均勻;槐糖脂作用組隨槐糖脂濃度增高細(xì)胞數(shù)量呈梯度減少,細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮,呈新月形發(fā)亮藍(lán)白色,呈現(xiàn)明顯的凋亡特征(見圖3)?；碧侵瑵舛忍荻仍黾訒r,鏡下出現(xiàn)藍(lán)色致密濃染的細(xì)胞比例也隨之增加(見圖3)。結(jié)果表明,槐糖脂能夠誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡,且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用強度與槐糖脂濃度成正比。

2.3 槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果分析,與空白對照組比較,槐糖脂(40,80,160 μg/ml)作用24 h后細(xì)胞熒光強度均顯著降低(見圖4)。定量分析,與空白對照組比較,40,80,160 μg/ml槐糖脂作用后細(xì)胞熒光強度均降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖5),提示槐糖脂作用SGC-7901細(xì)胞后造成細(xì)胞線粒體膜電位降低。

A. 空白對照組;B. 40 μg/ml槐糖脂組;C. 80 μg/ml槐糖脂組;D. 160 μg/ml槐糖脂組;E. 320 μg/ml槐糖脂組圖3 DAPI染色熒光顯微鏡下觀察槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 ( ×200)Figure 3 Effect of sophorolipid on apoptosis of SGC-7901 observed under fluorescent microscope (DAPI,×200)

圖4 Rhodamine 123染色法流式細(xì)胞術(shù)分析測定槐糖脂作用SGC-7901細(xì)胞后熒光強度變化Figure 4 Effect of sophorolipid on mitochondrial membrane potential after Rhodamine 123 staining by flow cytometry

2.4 槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組相比,槐糖脂作用組SGC-7901細(xì)胞Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05,見圖6);Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05,見圖6);槐糖脂處理后SGC-7901細(xì)胞漿中的Cyt-C蛋白水平顯著升高(P<0.05),Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05,見圖6)。

與空白對照組(0 μg/ml)比較,*P<0.05,* *P<0.01圖5 不同濃度槐糖脂作用SGC-7901細(xì)胞后熒光強度變化Figure 5 Effect of different concentrations of sophorolipid on fluorescent intensity of SGC-7901

與空白對照比較,*P<0.05,* *P<0.01圖6 槐糖脂對SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure 6 Effect of sophorolipid on apoptosis of related proteins in SGC-7901

3 討論

槐糖脂因其無毒、環(huán)保、可100%生物降解等優(yōu)點受到越來越多的關(guān)注,其抗腫瘤活性在醫(yī)藥行業(yè)展示出良好的前景,研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯型槐糖脂對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用[15],對乳腺癌細(xì)胞也表現(xiàn)出較大的毒性[16],但其對胃癌的作用及作用機制仍有待闡明。

該研究顯示內(nèi)酯型槐糖脂作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞后,細(xì)胞皺縮,體積變小,折光性明顯下降,部分細(xì)胞漂浮,細(xì)胞貼壁狀態(tài)差,隨著作用時間的延長,細(xì)胞基本脫落,細(xì)胞內(nèi)容物外溢、細(xì)胞解體,細(xì)胞核出現(xiàn)收縮、碎裂和溶解,細(xì)胞呈凋亡樣改變,細(xì)胞生存率顯著下降,由此可知槐糖脂對胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖具有很好的抑制作用。

研究證明,細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序死亡,可通過內(nèi)源性線粒體途徑實現(xiàn),凋亡過程中,線粒體膜的完整性被破壞[17],線粒體膜電位下降是細(xì)胞死亡早期的標(biāo)志性現(xiàn)象。羅丹明123(Rhodamine 123)是一種廣泛被用來檢測細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,Ψm)的熒光探針,實驗通過該方法發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯型槐糖脂可以顯著降低SGC-7901細(xì)胞線粒體跨膜電位,表明槐糖脂可引起SGC-7901細(xì)胞線粒體損傷,提示槐糖脂誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生程序死亡可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實現(xiàn)的。

線粒體凋亡途徑受Bcl-2家族成員的調(diào)控,包括抗凋亡的Bcl-2蛋白和促進(jìn)凋亡的Bax蛋白,其中線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵步驟是線粒體將胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C(Cyt-C)釋放至胞質(zhì)中[18]。Cyt-C與細(xì)胞質(zhì)中的凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease activating factor 1,Apaf-1)結(jié)合形成凋亡小體,導(dǎo)致Caspase-9原型活化進(jìn)而激活Caspase-3[19]。Caspase-3是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡程序中最為關(guān)鍵的限速酶,是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者[20]。Western blot結(jié)果顯示槐糖脂作用細(xì)胞后,線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下降,Bax、Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高,以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義,表明槐糖脂可能是促進(jìn)線粒體中的Cyt-c蛋白向胞質(zhì)釋放,進(jìn)一步通過激活Caspase 3和Caspase 9誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上結(jié)果提示線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是內(nèi)酯性槐糖脂誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生程序死亡的機制之一。

綜上所述,研究結(jié)果表明內(nèi)酯型槐糖脂可誘導(dǎo)SGC-7901腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,其機制可能與調(diào)低Bcl-2/Bax蛋白比值,從而引起Cyt-C的釋放,進(jìn)而導(dǎo)致Caspase 9和Caspase 3活化有關(guān)。結(jié)果提示線粒體途徑可能是內(nèi)酯型槐糖脂誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的途徑之一,其具體機制有待進(jìn)一步研究證明。