閔祥燕，曹寧，嚴懿嘉，陳志龍*

（1. 東華大學化學與生物學院，上海 201620；2. 上海先輝醫(yī)藥科技有限公司，上海 200433）

光動力療法（photodynamic therapy，PDT） 是一種微創(chuàng)、治療淺表性腫瘤的新方法，是將光敏劑（photosensitizer，PS）定位于靶組織上，PS吸收特定波長的光后，發(fā)生光化學反應(yīng)，進而殺傷和消滅目標位置上的腫瘤細胞。帕利泊芬（1，padelipor fin，WST11，Tookad?Soluble，Stakel?）是一種與鈀配位的細菌葉綠素衍生物，分子式：C37H41N5O9PdS（CAS：698393-30-5），由 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center、Steba Biotech 和 Weizmann Institute of Science 這 3 家公司聯(lián)合研制，已于2017年11月獲歐洲藥品管理局（EMA）批準上市，作為進行血管靶向PDT（vasculartargeted PDT，VTP）的PS，用于治療前列腺癌；其用于治療腎癌的研究處于Ⅱ期臨床階段。本品具有水溶性，靜脈給藥后，可靶向聚集于腫瘤組織，被適當波長的光激活并產(chǎn)生大量活性氧（ROS），進而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡或壞死。本文主要對帕利泊芬的作用機制、合成路線、藥理作用以及臨床研究進行介紹。

1 帕利泊芬作用機制

PS是一類在光照射下能產(chǎn)生ROS的化合物，理想的PS應(yīng)具有水溶性。此外，其激發(fā)波長應(yīng)在PDT光學“窗口”（650～850nm）內(nèi)，能最大化地穿透組織[1-3]。光動力療法主要有2種作用機制：激發(fā)態(tài)PS（S1）通過系間竄越將能量轉(zhuǎn)移到激發(fā)三重態(tài)（T1），并通過電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程直接與基質(zhì)或溶劑反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和超氧陰離子，超氧陰離子可進一步反應(yīng)生成過氧化氫（Ⅰ型反應(yīng)）；此外激發(fā)三重態(tài)PS也可以產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2），1O2可以通過誘導細胞凋亡或壞死直接殺死腫瘤細胞（Ⅱ型反應(yīng)）[4-6]。若超氧陰離子濃度過高，過氧化氫會與超氧陰離子反應(yīng)，生成具有更高活性的羥基自由基，而羥基自由基在細胞內(nèi)可以進攻和氧化任意的生物分子。此外也可能是由超氧陰離子與周圍的鐵離子或銅離子之間發(fā)生芬頓反應(yīng)（Fenton’s reaction），產(chǎn)生羥基自由基[6-10]。帕利泊芬作為一種高效的PS，在水溶液中經(jīng)歷Ⅰ型反應(yīng)機制[11]，產(chǎn)生了帶電或中性自由基，這些自由基迅速與氧分子反應(yīng)生成ROS，從而殺死腫瘤細胞。光敏劑作用機制如圖1所示。

圖1 光敏劑作用機制Figure 1 Mechanism of photosensitizer

2 帕利泊芬的發(fā)現(xiàn)歷程及其合成路線

在帕利泊芬問世之前，已有數(shù)個卟啉類藥物被用于腫瘤的臨床治療。血卟啉衍生物Photo fin是全球首個獲批準上市的光敏劑，隨后與Photo fin結(jié)構(gòu)相近的卟啉衍生物喜泊芬及Photogem等也先后在俄羅斯、德國和中國上市。然而，這類光敏劑存在一些缺點：首先，其吸收波長為410nm，接近太陽光的輻射波長（475nm），且光敏劑在體內(nèi)滯留時間較長，PDT治療后患者會出現(xiàn)明顯皮膚光毒性，病人需在治療后避光28～42d；其次，治療使用的可見光的組織穿透強度較弱，治療深度淺；另外，此類PS摩爾吸光系數(shù)小，因此往往需要提高藥物劑量或光劑量來達到治療效果，毒副作用大。

近年來，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向了葉綠素和細菌葉綠素的衍生物，其具有特定的吸收光譜區(qū)域（650～850nm）和激活后能快速降解的特性，被認為是兩類更具優(yōu)勢的PS。與葉綠素類衍生物相比，細菌葉綠素衍生物是一類具有2個不飽和吡咯環(huán)的四吡咯大環(huán)，其通常在近紅外（NIR）范圍內(nèi)的750nm處的PDT光學窗口內(nèi)具有Qy吸收帶，在近紅外光區(qū)組織滲透至8mm[12]。不過，細菌葉綠素衍生物在常溫常壓下不穩(wěn)定，且與血卟啉衍生物相比，其單線態(tài)氧的產(chǎn)量較低（由中心金屬離子決定）[13]。為了增加細菌葉綠素衍生物在常溫常壓下的穩(wěn)定性，Avigdor等[13]嘗試將其中心原子Mg替換為2價的Pd、Pt、Sn、Ni、Cu、Zn和Mn等。該課題組發(fā)現(xiàn)，中心原子Mg被Pd取代后，可顯著增加細菌葉綠素大環(huán)的氧化電位，同時可以大大提高分子的跨系統(tǒng)速率，使其達到激發(fā)三重態(tài)。Pd-細菌葉綠素衍生物的生物分布和藥動學研究顯示，其僅保留在血液循環(huán)中且在光照后的保留時間很短，解決了病人在PDT后需長期避光的問題。然而，Pd-細菌葉綠素衍生物在水溶液中溶解度低，配制注射藥物時，需要使用增溶劑（如氫化蓖麻油）來增加其溶解性，使用大劑量的增溶劑曾在小鼠實驗中引發(fā)了諸多不良反應(yīng)（如呼吸急促、萎靡不振等）。因此，增加Pd-細菌葉綠素衍生物的水溶性是迫切需要解決的另一個問題。

此前，有研究發(fā)現(xiàn)細菌葉綠素a（2）的17位碳原子位置被氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等多種分子取代后，可增加化合物的親水性[14]。Rosenbach-Belkin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，細菌葉綠素的絲氨酸衍生物水溶性顯著改善，且在小鼠實驗中顯示出較快的血液循環(huán)清除速率。遺憾的是，絲氨酸-細菌葉綠素衍生物極不穩(wěn)定，能被光迅速氧化。但這也為Avigdor等研究如何提高Pd-細菌葉綠素衍生物溶解度提供了有意義的參考，即在Pd-細菌葉綠素衍生物17位碳原子位置引入親水基團，如COO-、COS-、SO3-和 PO32-等[12]。在 Pd-細菌葉綠素衍生物的17位碳原子位置引入SO3-，即制得帕利泊芬，其可直接溶于水。此外，生物分布和藥動學分析研究亦獲得了令人滿意的結(jié)果。在荷有M2R黑素瘤和HT-29結(jié)腸癌的模型小鼠中進行的研究證實帕利泊芬具有顯著抗腫瘤作用，另外，該藥物在動物體內(nèi)的清除速率快，是非常理想的血管靶向PS。

圖2介紹了帕利泊芬及其前體藥物padopor fin（3，WST09）的合成路線。值得一提的是，padopor fin也曾進入前列腺癌治療的臨床階段，但研究結(jié)果顯示其會引發(fā)低血壓等副作用，且副作用較大[16-21]。根據(jù)文獻方法，首先從球形細菌的培養(yǎng)物中提取得到原料細菌葉綠素a，通過稀鹽酸脫去配位金屬Mg，得到化合物4。隨后將醋酸鈀加入到化合物4的二氯甲烷/甲醇混合溶液中，在氬氣保護下室溫過夜攪拌，鰲合形成padopor fin[22]。最后，將padopor fin完全溶解于DMSO中，并加入催化當量的1，3-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP），最后添加適量溶解?；撬岬腒2SO3溶液（pH=8.2），在氮氣保護條件下室溫避光攪拌4d，最終得到13-C位置開環(huán)的產(chǎn)物，即帕利泊芬[13,23]。

圖2 帕利泊芬的合成線路Figure 2 Synthetic route of padeliporfin

3 帕利泊芬的藥理學研究

3.1 體外研究

3.1.1 細胞對帕利泊芬的攝取與細菌葉綠素衍生物的性質(zhì)類似，帕利泊芬呈現(xiàn)出非常弱的熒光，因此不能通過熒光法來對細胞攝取帕利泊芬進行定量檢測[24]。每個帕利泊芬分子結(jié)構(gòu)中都含有一個Pd原子，且生理條件下吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)螯合的Pd離子非常穩(wěn)定，因此，可以通過測定細胞中的Pd原子含量，來表征細胞對帕利泊芬的攝取量[24]。

Posen等[25]將小鼠黑素瘤單層細胞分別與濃度為0、15、30、60 和 100nmol·L-1的帕利泊芬溶液一起孵育 4h，然后用功率為20mW的激光器照射10min。光照后立即用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定細胞內(nèi)Pd原子的含量，從而確定細胞內(nèi)帕利泊芬的含量。結(jié)果顯示，隨著帕利泊芬濃度的遞增，檢測到細胞內(nèi)Pd原子的含量也遞增。光照后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進行噻唑藍（MTT）檢測，測定細胞的存活率。結(jié)果表明，隨著帕利泊芬濃度的遞增，細胞攝取到的帕利泊芬也增多，胞內(nèi)帕利泊芬在光照下被激活后，細胞存活率隨溶液中帕利泊芬濃度遞增而降低（見圖3）。

圖3 黑素瘤細胞在不同濃度帕利泊芬溶液中的Pd攝取量及光照后存活率Figure 3 The Pd uptake and survival rate of melanoma cells at different concentrations of padeliporfin

Brandis等[23]研究了溫度和血清等因素對細胞攝取帕利泊芬的影響，發(fā)現(xiàn)在37℃時，細胞中帕利泊芬濃度在最初 5～10min 內(nèi)迅速增加，于培養(yǎng)開始后的 50～60min趨于穩(wěn)定；而溫度降至4℃時，帕利泊芬能夠迅速滲透入細胞并在培養(yǎng)10min后胞內(nèi)濃度達到平穩(wěn)；在沒有血清的情況下帕利泊芬能形成直徑為1～2nm的小聚集體，但小聚集體并不影響細胞膜的吸附[26]。黑色素瘤細胞攝取帕利泊芬的實驗結(jié)果表明，帕利泊芬在細胞中的攝取是由血清白蛋白運輸介導的。Mazor等[24]也證明了帕利泊芬與血清白蛋白絡(luò)合會促進細胞攝取帕利泊芬。

3.1.2 帕利泊芬的細胞毒性研究在細胞PDT實驗中，隨著帕利泊芬濃度的增加，細胞存活率遞減。為了確定是單純的高濃度藥物殺死了細胞，還是藥物發(fā)生光化學反應(yīng)后殺死細胞，Posen等[25]將小鼠胚胎心臟內(nèi)皮細胞（H5V）分別與不同濃度（0、10、100和1000nmol·L-1）的帕利泊芬一起孵育 4h 后，分別用功率為20mW的激光器照射10min以及避光處理，然后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，分別對細胞進行MTT檢測，測定細胞的存活率。研究顯示，光照處理的細胞，隨著培養(yǎng)物中帕利泊芬濃度的增加，細胞存活率下降，半數(shù)致死劑量（LD50）約為 30nmol·L-1；相反，對于避光處理的細胞，帕利泊芬濃度對細胞存活率影響不明顯（見圖4）。因此細胞攝取到的帕利泊芬，只有在被光激活后才會殺死細胞且細胞存活率隨帕利泊芬濃度遞增而降低。即帕利泊芬對細胞的光毒性明顯，而暗毒性很小。

圖4 帕利泊芬在光照和避光條件下的細胞毒性Figure 4 Cytotoxicity of padeliporfin under light and dark conditions

3.2 動物體內(nèi)研究

利用腫瘤動物模型進行PDT實驗是篩選抗腫瘤PS的常用手段之一。Mazor等[24]將黑素瘤模型小鼠分為實驗組和對照組，給實驗組小鼠尾靜脈注射帕利泊芬（6mg·kg-1），然后用 45J·cm-2的激光照射，經(jīng)皮照射腫瘤部位5min；對照組小鼠接受給藥不照光、照光不給藥或不給藥亦不照光的處理方式。結(jié)果顯示，接受不同處理的對照組小鼠，其腫瘤生長速率相似，且尾靜脈注射30min后未觀察到小鼠出現(xiàn)皮膚光毒性。在PDT實驗后，所有實驗組小鼠經(jīng)治療的腫瘤部位在24～48h內(nèi)均發(fā)生腫瘤組織的壞死，小鼠繼續(xù)養(yǎng)殖14d后原腫瘤部位均變平，到90d后約有60%的小鼠被治愈。

此外Fleshker等[27]也開展了類似研究，對荷有CT26 結(jié)腸癌的小鼠尾靜脈注射帕利泊芬（6mg·kg-1），然后進行PDT治療。治療后，向小鼠體內(nèi)注射可識別腫瘤的熒光素，再用生物熒光成像（bioluminescence imaging，BLI）監(jiān)測每只小鼠的腫瘤變化情況，若BLI信號為陰性則說明小鼠體內(nèi)沒有腫瘤，若BLI信號為陽性則說明小鼠體內(nèi)有腫瘤。實驗中共有53只小鼠接受PDT，其中有40例BLI信號為陰性，有39例在隨后的90d觀察期間未觀察到BLI陽性信號，僅有1例在PDT后第30d死亡（未見腫瘤再生），即PDT后約75%（40/53）的小鼠腫瘤治愈，其余13只小鼠PDT24h后，觀察到BLI陽性信號，且在隨后的觀察期間可見局部腫瘤復發(fā)。實驗結(jié)果表明，帕利泊芬治療結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠的療效顯著。

4 帕利泊芬治療前列腺癌的臨床應(yīng)用

帕利泊芬作為治療前列腺癌的新型血管靶向PS，已成為PDT研究領(lǐng)域近年來的熱點。臨床上，全身麻醉的前列腺癌患者接受靜脈注射帕利泊芬（4mg·kg-1），同時，經(jīng)直腸和會陰將裝有超聲光纜的中空塑料針置于患者前列腺內(nèi)，用光纖功率為150mW的激光照射，其輸送的纖維數(shù)量和總光能隨腫瘤位置和前列腺體積而變化[28]，可用于局部前列腺癌的治療。

Lebdai等[26]對82名前列腺癌患者靜脈注射帕利泊芬（4mg·kg-1）后進行 PDT 治療，治療 6 個月后對所有患者進行前列腺活檢。結(jié)果顯示，有62名（76%）患者活檢結(jié)果為陰性，20名患者活檢結(jié)果為陽性，其中，有9名（11%）患者為臨床顯著癌（clinically signi ficant cancer），另外的11名（13%）患者為臨床非顯著癌（non-clinically signi ficant cancer）。此外，Azzouzi等[29]也開展了類似的臨床研究，對114名前列腺癌患者進行PDT，治療6個月后對所有患者進行前列腺活檢，其中有78名（68.4%）患者的活檢結(jié)果為陰性。上述臨床研究結(jié)果均證實帕利泊芬治療前列腺癌療效顯著。

5 帕利泊芬治療前列腺癌的優(yōu)勢

5.1 水溶性好，靶向性高

帕利泊芬是一種水溶性的血管靶向PS，通過血液循環(huán)可直接靶向聚集于前列腺癌細胞，并在癌細胞內(nèi)被激活，從而產(chǎn)生大量的ROS，發(fā)揮其治療前列腺癌的功能[30]。

5.2 代謝快，體內(nèi)無蓄積

Brandis等[23]研究了帕利泊芬在小鼠和大鼠中的藥動學特性，發(fā)現(xiàn)帕利泊芬僅保留在血液循環(huán)中，且血液中的保留時間非常短。Mazor等[24]對小鼠尾靜脈注射帕利泊芬（6mg·kg-1），并在此后的不同時間點，分別測定小鼠心、肝、脾、肺、腎以及血液中的藥物濃度。結(jié)果顯示，尾靜脈注射2min后，血液中帕利泊芬的含量最高，在注射后5min僅在肝、脾、肺、腎和血液中發(fā)現(xiàn)存有帕利泊芬。給藥24h后，所有組織中均檢測不到帕利泊芬。帕利泊芬能在組織中快速清除可能與引入的?；撬峄鶊F有關(guān)[31]。?；撬崾羌毎褐械摩?氨基酸，廣泛分布于哺乳動物的肝臟中，參與肝臟的解毒。在解毒過程中，?；撬崤c肝臟中不同分子結(jié)合可增加藥物的水溶性，從而促進了肝臟對藥物的清除[32]。圖7顯示了帕利泊芬在小鼠體內(nèi)的生物分布情況。研究人員發(fā)現(xiàn)帕利泊芬可以從血液中快速消除，不會在皮膚組織中積聚，從而確保帕利泊芬具有較低的皮膚光毒性[33]。

5.3 安全性高

Lebdai等[26]使用IPSS和IIEF-5問卷分別評估了前列腺癌患者在PDT治療后的泌尿系統(tǒng)癥狀和勃起功能。40名前列腺癌患者經(jīng)PDT治療后，其中有38名患者在治療后第1d無需導尿管，另外2名患者在PDT治療幾天后也無需導尿管。臨床研究結(jié)果證明帕利泊芬不會引起患者的心血管毒性或肝酶改變、術(shù)中麻醉問題、直腸瘺或皮膚光敏等，IPSS評分和IIEF-5評分也未受較大影響。綜合評價認為，帕利泊芬在臨床使用方面具有良好的安全性。

6 結(jié)語與展望

隨著新型PS的不斷開發(fā)，PDT在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛。帕利泊芬作為一種水溶性的血管靶向PS，可直接靶向聚集于腫瘤細胞，在腫瘤細胞內(nèi)被激活，發(fā)生一系列的光化學反應(yīng)從而發(fā)揮抗腫瘤療效。目前研究認為，帕利泊芬治療前列腺癌有較好療效，但患者經(jīng)PDT后會產(chǎn)生血尿、會陰疼痛和射精失敗等副作用，還需要其他輔助療法來消除這些副作用。因此帕利泊芬治療前列腺癌引起的不良反應(yīng)還需要進一步的深入研究，這將有助于帕利泊芬的合理應(yīng)用，對其能夠安全有效地用于治療前列腺癌具有重要的指導意義。隨著對帕利泊芬治療前列腺癌的藥理作用和機制的深入研究以及在臨床上的應(yīng)用，人們對PDT的認知將更為全面，可以相信，未來將會有更多的PS被研發(fā)出來，在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

圖5 帕利泊芬給藥后在小鼠體內(nèi)的生物分布Figure 5 Biodistribution of padeliporfin in mice after administration