冀倩倩 ，朱士茂 ，吳彥萍 ，吳櫻丹 ，陳楚如 ，李云富 ，郭采平 *

（1.深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司，廣東 深圳 518107；2.深圳重組血漿蛋白類創(chuàng)新藥物工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518107）

血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，病癥多為自發(fā)性或輕度外傷后出血不止，輕則造成患者終生殘疾，重則短時(shí)間即可危及患者生命。血友病尚無根治辦法，目前的治療方法主要為替代療法，通過長期輸注血漿、缺失的凝血因子的方式來治療。血友病治療最嚴(yán)重的并發(fā)癥是中和性抗體（抑制物）的形成，從而阻礙了替代療法的止血作用。抑制物的產(chǎn)生導(dǎo)致血友病患者的致殘率和死亡率增高，只有少數(shù)旁路制劑可用于這些患者的出血治療，如活化凝血酶原復(fù)合物濃縮物（aPCC）和重組活性凝血因子Ⅶ（rFVIIa）。在A型血友病中，約30%的重癥患者和5%～10%的非重癥患者會產(chǎn)生抑制物，B型血友病患者有3%～5%會產(chǎn)生抑制物[1]。

活化的rFVII對于A型和B型血友病都具有良好的治療效果，同時(shí)對體內(nèi)產(chǎn)生抑制性抗體的血友病患者同樣具有治療效果[2]，是目前臨床治療血友病的最常用藥物之一。由于血液中 FVII含量較低（0.5～2.0mg·L-1，其中FVIIa僅占1%），且半衰期非常短（約2.5h），血液提取難度非常大，因此利用基因重組技術(shù)表達(dá)rFVIIa是目前唯一可行的方法。諾其是丹麥諾和諾德（Novo Nordisk）公司在1999年上市的rFVIIa，由新生倉鼠腎宿主（BHK）細(xì)胞表達(dá)。rFVIIa和血漿來源的FVIIa的結(jié)構(gòu)、功能研究顯示，二者僅在翻譯后修飾γ羧基化和N糖基化中有微小差異，但功能基本一致，均可以縮短體外凝血時(shí)間，并對無抑制物和伴發(fā)抑制物的血友病患者均具有治療作用[3-4]。諾其主要用于治療存在Ⅷ因子（FVIII）或Ⅸ因子（FIX）中和抗體的先天性血友病和繼發(fā)性血友病患者的自發(fā)性或手術(shù)性出血，在歐洲還被批準(zhǔn)用于獲得性血友病的治療[5]；此外，還可用于產(chǎn)婦分娩出血的治療。但藥物的半衰期短，約2.9h，自發(fā)性出血標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括單次注射 270 μg·kg-1，或出血后每 3h 注射 90 μg·kg-1，共 3 次。

在伴發(fā)抑制物的血友病患者的大手術(shù)和嚴(yán)重出血治療中，rFVIIa 的有效率達(dá) 80%～90%[6]，已被作為藥物使用了20多年，極少出現(xiàn)血栓事件或免疫原性報(bào)告[7-8]。但rFVIIa蛋白的半衰期短，導(dǎo)致在急性出血或預(yù)防性治療方案中需要頻繁輸注，不僅增加了患者的痛苦和不便，也增加了治療成本，限制了其作為血友病預(yù)防治療制劑的應(yīng)用。凝血因子是治療血友病不可替代的藥物，患者需終身輸注，為減輕患者負(fù)擔(dān)，增加患者依從性，亟需開發(fā)長效rFVIIa產(chǎn)品。延長半衰期的長效rFVIIa可以減少注射次數(shù)，減輕患者負(fù)擔(dān)和痛苦，從而改善患者的生活質(zhì)量，并使rFVIIa用于血友病的預(yù)防治療成為可能。

長效凝血因子近幾年已成為國際上的研究熱點(diǎn)。如長效FIX產(chǎn)品通過融合抗體Fc段或白蛋白等技術(shù)，成功地將注射頻率從每周2次降低到每10～14d給藥1次[9-10]；長效FVIII產(chǎn)品將注射頻率從每周3次減少到2次[11-12]。由于rFVIIa的主要臨床適應(yīng)證是伴發(fā)抑制物的血友病，患者病例數(shù)相對較少，致使臨床研究存在難度大、周期長、成本高等問題，給rFVIIa新藥的開發(fā)增加了一定的難度，至今尚無長效rFVIIa產(chǎn)品研制成功。本文對應(yīng)用聚乙二醇（PEG）修飾、序列突變和融合蛋白技術(shù)等研制的長效rFVIIa產(chǎn)品進(jìn)行介紹，為國內(nèi)rFVIIa藥物研發(fā)提供參考和依據(jù)。

國際上，包括CSL、諾和諾德、拜耳（Bayer）等多家企業(yè)均開展了長效rFVIIa產(chǎn)品的開發(fā)工作，大部分已進(jìn)入臨床研究開發(fā)階段，如表1所示。

表1 長效重組活性凝血因子Ⅶ研發(fā)概況Table 1 Development review of long-acting recombinant activated FⅦ

1 重組活性凝血因子Ⅶ-白蛋白融合蛋白

人血清白蛋白（albumin）是血漿中含量最多的可溶性蛋白，半衰期長達(dá)19d，無免疫原性，組織分布廣，是天然的藥物載體，融合人血清白蛋白是蛋白質(zhì)藥物長效化改造的一種常用選擇。白蛋白相對分子質(zhì)量為66500，是腎小球?yàn)V過蛋白的上限，有助于延緩腎臟的濾過作用[13]。此外，白蛋白還以pH依賴的方式結(jié)合新生的Fc受體（FcRn），避免了溶酶體酶的降解，并進(jìn)入再循環(huán)機(jī)制，從而延長了其半衰期[14-15]。

rFVIIa-白蛋白融合蛋白是通過cDNA拼接技術(shù)將FVII與585個(gè)氨基酸組成的白蛋白通過甘氨酸絲氨酸柔性接頭連接在一起，并在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[16]。大鼠藥代動力學(xué)研究表明，rFVIIa-白蛋白融合蛋白的半衰期比野生型rFVIIa延長了6.7倍，比商品化諾其延長5.8倍[16]。體外和體內(nèi)療效評估結(jié)果顯示，rFVIIa-白蛋白融合蛋白功能活性可與商品化rFVIIa相媲美[16-17]。動物實(shí)驗(yàn)中，rFVIIa-白蛋白融合蛋白不僅半衰期和活性時(shí)間顯著延長，還增強(qiáng)動物康復(fù)效果、降低了藥物的血漿清除速率[17]。組織分布研究顯示，在大鼠膝關(guān)節(jié)處，rFVIIa-白蛋白融合蛋白維持活性的時(shí)間相比諾其延長了10倍，這種特征更有利于提高患者的用藥依從性[18]。杰特貝林在健康志愿者體內(nèi)進(jìn)行了rFVIIa-白蛋白融合蛋白的Ⅰ期臨床研究。與商業(yè)化的rFVIIa產(chǎn)品相比，rFVIIa-白蛋白融合蛋白半衰期延長了約3～4倍，約8.5h，藥代動力學(xué)活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)展示出了良好的安全性和耐受性[19]。試驗(yàn)中僅有1例輕微不良反應(yīng)記錄，表現(xiàn)為靜脈注射位點(diǎn)疼痛和僵硬。注射后28d檢測期內(nèi)沒有檢測到任何抗藥抗體。目前，將rFVIIa-白蛋白融合蛋白用于A型或B型血友病患者、伴發(fā)抑制劑患者以及FVII缺乏癥患者的臨床Ⅱ/Ⅲ期研究（NCT02484638）正在進(jìn)行中。

2 重組活性凝血因子Ⅶ-人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽融合蛋白

人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端肽（Carboxylterminal peptide of human chorionic gonadotropin，CTP）也是構(gòu)建長效融合蛋白的一個(gè)常用選擇。CTP融合可以增加重組融合蛋白唾液酸含量，從而增加蛋白的黏度，遮蔽蛋白上的糖鏈，使其不被糖苷酶水解，保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白酶降解；同時(shí)可提高蛋白質(zhì)糖基化程度，增加相對分子質(zhì)量，因此可以獲得更長的藥物體內(nèi)半衰期[20]。由于CTP是人體自身的天然蛋白片段，免疫原性非常低，且分子構(gòu)建更簡單靈活，不需要插入連接序列而直接在蛋白C端或N端融合。

按照氨基酸序列推算，rFVIIa-CTP融合蛋白相對分子質(zhì)量約54000，但經(jīng)糖基化修飾后，其相對分子質(zhì)量高達(dá)70000。與rFVIIa相比，二者與組織因子（TF）的親和力相當(dāng)，但rFVIIa-CTP融合蛋白的特異性降低；在相似用藥濃度情況下，rFVIIa-CTP融合蛋白顯示了較弱的血小板結(jié)合力和較低的凝血酶生成量[21]。將長效rFVIIa-CTP用于健康男性的Ⅰ期臨床研究（NCT02919800）以及用于血友病患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究（NCT02418793）目前正在同時(shí)開展中。

3 重組活性凝血因子Ⅶ-Fc融合蛋白

免疫球蛋白Fc片段與血清白蛋白相似，可通過增加功能蛋白的相對分子質(zhì)量降低腎小球的濾過率，同時(shí)通過FcRn介導(dǎo)的、pH依賴性再循環(huán)機(jī)制有效地避免蛋白降解，從而增加融合蛋白的穩(wěn)定性，延長體內(nèi)半衰期[14,22]。Fc融合技術(shù)已被應(yīng)用于FVIII和FIX產(chǎn)品的開發(fā)，在臨床前和臨床研究中均顯示了延長的凝血因子活性和半衰期[12,23-24]。rFVIIa-Fc融合蛋白在血友病A模型小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，顯示了與rFVIIa相似的凝血活性功能，且半衰期延長了5.5倍[25]。

rFVIIa-Fc融合蛋白現(xiàn)已經(jīng)SYNTONIX制藥公司申請國際專利（授權(quán)公開號：PCT/US2004/013940），但尚無在人體中的臨床研究開發(fā)記錄。國內(nèi)安源生物也申請了相關(guān)專利“改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制備方法與用途”（授權(quán)公開號：CN103397009B）。

4 聚乙二醇修飾的重組活性凝血因子Ⅶ

蛋白質(zhì)的PEG修飾也是用于延長蛋白藥代動力學(xué)和提高藥效的常用方法，其原理主要是通過PEG修飾增加分子體積，降低腎小球的濾過作用，提高水溶性等。諾和諾德開發(fā)出一種由相對分子質(zhì)量為40000的糖化PEG修飾的rFVIIa（產(chǎn)品代號：N7-GP），旨在預(yù)防A型血友病或B型血友病伴發(fā)抑制劑患者的出血發(fā)作。PEG修飾可延長rFVIIa在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期，但同時(shí)PEG分子產(chǎn)生的空間位阻阻礙了rFVIIa與組織因子等蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致凝血功能活性下降[26-27]。在臨床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中，N7-GP都顯示了較諾其顯著延長的藥物半衰期。動物實(shí)驗(yàn)顯示，N7-GP的循環(huán)系統(tǒng)半衰期（高達(dá)25h）是商品化rFVIIa的5～6倍；但是等物質(zhì)量的蛋白的凝血活性顯著降低，需要更高的藥物濃度以實(shí)現(xiàn)止血效果[28-29]。Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示，N7-GP平均半衰期為15h，與安慰劑組相比，N7-GP組平均凝血酶原時(shí)間顯著降低，并表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性[30]。但Ⅱ期臨床研究因未顯示有效的劑量效應(yīng)而終止（NCT00951405）[31]。N7-GP臨床Ⅱ期的失敗提示，僅延長rFVIIa的半衰期是不夠的，還應(yīng)在體循環(huán)中維持一段時(shí)間的高水平凝血活性。

5 蛋白序列突變的重組活性凝血因子Ⅶ

拜耳開發(fā)了一種半衰期延長、活性增加的rFVIIa變體——BAY86-6150，其通過點(diǎn)突變方法在FVII編碼序列中引入氨基酸，從而增強(qiáng)了rFVIIa對激活的血小板的親和力，并產(chǎn)生了2個(gè)額外的N糖基化位點(diǎn)[32]。在臨床前小鼠試驗(yàn)和體外研究中，BAY86-6150被證明耐受性良好，顯示了增強(qiáng)的促凝活性，相比于商品化rFVIIa，半衰期有效延長。在早期臨床試驗(yàn)中BAY86-6150也獲得良好評價(jià)，臨床表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白穩(wěn)定性，半衰期延長近3倍，但在Ⅱ/Ⅲ期的臨床試驗(yàn)（NCT01625390）中，由于患者產(chǎn)生了可與內(nèi)源性FVIIa交叉反應(yīng)的抑制物，發(fā)生嚴(yán)重免疫反應(yīng)而宣告終止研究[33-34]。推測可能與氨基酸突變引起的蛋白分子構(gòu)象的改變有關(guān)[35]。

6 結(jié)語

血友病本身是一種罕見病，而FVII的主要臨床適應(yīng)證是伴發(fā)抑制劑的血友病，病例數(shù)相對較少，致使臨床研究存在周期長、成本高等問題，給新藥的開發(fā)增加了一定的難度，至今沒有長效藥物開發(fā)上市。

盡管一些非因子類血友病藥物，如羅氏的雙特異抗體emicizumab[36-37]（FIXa和Ⅹ因子雙特異抗體，商品名：Hemlibra）已被開發(fā)出來，但其價(jià)格高昂，推廣存在一定的難度。Hemlibra用于體內(nèi)產(chǎn)生FVIII抑制因子的A型血友病的常規(guī)預(yù)防，研究顯示接受Hemlibra預(yù)防治療的伴發(fā)抑制劑患者年出血率低于預(yù)防性旁路治療的患者，但使用后有些患者需要再使用含有FIXa的旁路制劑才能更有效控制出血，臨床試驗(yàn)中曾有4名患者同時(shí)使用旁路制劑發(fā)生血栓事件，尚有不清晰的缺陷需要探索。

基因治療是目前徹底治愈血友病的唯一希望。Spark Therapeutics、BioMarin 和 UniQure Biopharma 等多家公司都在針對血友病的基因治療進(jìn)行臨床試驗(yàn)，且初見成效[38-40]。但基因治療也還存在一些難以避免的缺陷：患者免疫系統(tǒng)容易攻擊修改后的細(xì)胞或肝臟細(xì)胞，導(dǎo)致不能分泌足夠多的凝血因子，甚至發(fā)生肝細(xì)胞毒性；隨著時(shí)間的推移，基因療法效果可能會減弱；病毒載體的潛在風(fēng)險(xiǎn)等[41-46]。

伴發(fā)抑制劑的血友病患者的治療存在著明顯的未被滿足的臨床需求，其中最重要的是需要延長藥物的給藥間隔，改善臨床效果。目前所有研究數(shù)據(jù)顯示，rFVIIa-白蛋白融合蛋白最有希望滿足以上需求，有望在未來5～10年內(nèi)成功上市，從而使伴發(fā)抑制物的血友病患者預(yù)防性治療方案成為可能。而基因治療方法尚存在一定的問題和爭議，但在長遠(yuǎn)的未來，基因治療技術(shù)將會隨著科學(xué)的進(jìn)步和技術(shù)的發(fā)展逐漸完善，有望實(shí)現(xiàn)其一勞永逸的治療效果。