劉夢，于彭城，徐寒梅

（中國藥科大學(xué)江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評價工程研究中心，江蘇 南京211198）

蛋白多肽類藥物毒性小、特異性強(qiáng)，針對某些疾病的藥理活性較好，在藥物開發(fā)中被認(rèn)為是十分有前途的生物大分子，但此類藥物穩(wěn)定性較低、易被體內(nèi)各種酶降解以及腎清除迅速，導(dǎo)致其半衰期較短，從而限制了藥物的使用。因此，開展蛋白多肽類藥物長效化相關(guān)研究十分重要，延長其血漿半衰期的策略不僅可以改善既定藥物的藥動學(xué)特性，也可能為藥物使用開發(fā)新的適應(yīng)證。本文基于蛋白多肽類藥物藥動學(xué)特點(diǎn)，綜述了蛋白多肽類藥物長效化技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 蛋白多肽類藥物藥動學(xué)特點(diǎn)

1.1 吸收

蛋白多肽類藥物因相對分子質(zhì)量的不同，其吸收方式也存在一定差異。通常，小肽的吸收方式包括載體轉(zhuǎn)運(yùn)和被動擴(kuò)散；大分子蛋白多肽的吸收方式包括膜脂擴(kuò)散以及細(xì)胞間隙擴(kuò)散；高度親脂性藥物則能通過淋巴途徑吸收進(jìn)入體內(nèi)[1]。由于胃腸道蛋白降解酶對于蛋白多肽類藥物降解作用的影響，此類藥物口服給藥生物利用度較低，多數(shù)都優(yōu)先選擇注射給藥，但也因此影響了患者的用藥順應(yīng)性。研究者一直致力于開發(fā)適合蛋白多肽藥物的非注射給藥途徑，目前有望通過納米技術(shù)克服這一瓶頸[2]。除了聯(lián)合給藥及對藥物進(jìn)行改造，目前還開發(fā)了多種技術(shù)模型來研究及預(yù)測蛋白多肽類藥物在體內(nèi)的腸道吸收及其體內(nèi)生物利用度[3]。皮下注射是蛋白多肽藥物重要的給藥途徑，此種給藥方式吸收過程較為緩慢，能維持藥物在體內(nèi)穩(wěn)定的效應(yīng)，并且可以避開肝首過效應(yīng)，降低藥物的給藥劑量[4]。

1.2 分布

蛋白多肽類藥物在體內(nèi)的分布主要由擴(kuò)散和較小程度的對流外滲組合驅(qū)動，分布體積通常不大于細(xì)胞外體液的體積[5]。另外，此類藥物體內(nèi)分布具有明顯的靶向性，根據(jù)此特點(diǎn)可開發(fā)靶向給藥，使藥物能夠快速到達(dá)病灶部位發(fā)揮藥物療效。Han等[6]利用丙氨酰-谷氨酰-酪氨酰-亮氨酰-精氨酸序列（AEYLR）作為體外靶向表皮生長因子受體（EGFR）的小肽配體，研究了AEYLR和AEYLR共軛納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）的體內(nèi)靶向性。結(jié)果表明，AEYLR修飾的NLC是有希望用于聯(lián)合癌癥化學(xué)療法的靶向遞送系統(tǒng)，不僅能提高治療效果，也能減少毒副作用。研究人員對切割人血清白蛋白得到的白蛋白片段進(jìn)行光學(xué)成像研究，發(fā)現(xiàn)其可選擇性地積聚在腎臟中，可作為腎靶向的預(yù)期載體[7]。精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸序列（RGD）與包封有熒光染料吲哚菁綠（ICG）的聚乙二醇（PEG）化脂質(zhì)體的綴合物，可作為一種有效的遞送系統(tǒng)靶向胃癌細(xì)胞中高表達(dá)的整合素受體[8]。

1.3 代謝和消除

血液、肝臟、腎臟和小腸中含有各種蛋白酶和肽酶，是蛋白多肽類藥物發(fā)生降解的主要部位。除此之外，因蛋白酶和肽酶也存在于全身其他部位，此類藥物的代謝并不限于經(jīng)典的消除器官，大多數(shù)半衰期短的多肽主要經(jīng)過肽酶快速水解被消除。通常，相對分子質(zhì)量較小的多肽可以通過腎臟中的腎小球自由過濾，然后在近端小管細(xì)胞的刷狀緣膜中水解降解。理論研究和臨床數(shù)據(jù)表明，對于蛋白類治療劑，腎臟可在一定程度上調(diào)節(jié)這些物質(zhì)的功效或安全性，并在分解代謝中發(fā)揮相關(guān)作用[9]。若機(jī)體對蛋白水解具有抗性，則主要通過腎臟消除。例如，艾塞那肽是胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）模擬物，含有39個氨基酸，氨基酸取代使艾塞那肽對二肽基肽酶-4的降解產(chǎn)生抗性，因此艾塞那肽經(jīng)腎小球濾過后在腎小管中酶促降解[10]。

肝臟代謝可能主要對一些小肽藥物的代謝消除具有實質(zhì)性作用，例如用于治療多發(fā)性骨髓瘤的二肽硼替佐米會經(jīng)歷廣泛的氧化性肝代謝，但若機(jī)體肝功能發(fā)生損傷，則清除率會降低[11]。類似地，環(huán)狀十一肽環(huán)孢素通過被動擴(kuò)散進(jìn)入肝細(xì)胞，幾乎完全經(jīng)過肝臟代謝消除[12]。

蛋白多肽類藥物還具有非線性藥動學(xué)特征：大部分藥物與藥理學(xué)靶標(biāo)高度結(jié)合，隨后消除藥物-靶標(biāo)復(fù)合物，由于受體的數(shù)量有限，會出現(xiàn)劑量依賴性非線性藥動學(xué)，如血小板生成素模擬肽靶向介導(dǎo)藥物的處置過程顯示出明顯的劑量依賴性[13]。

2 改善蛋白多肽類藥物半衰期的方式

天然的蛋白多肽類藥物通常具有較差的吸收、分布、代謝和排泄特性，如半衰期短、滲透性低，有時溶解度也較低[14]。為了更加充分地發(fā)揮藥物的治療效果，提高患者的耐受性，目前已經(jīng)開發(fā)出多種改善蛋白多肽類藥物穩(wěn)定性的策略，延長體內(nèi)半衰期，使其長效化。

2.1 氨基酸替代

蛋白多肽類藥物含有的某些代謝不穩(wěn)定的氨基酸，會極大地影響藥物的半衰期，因此取代這類代謝不穩(wěn)定的氨基酸是延長藥物半衰期的一種方式。生長抑素是一種多肽類藥物，含有14個氨基酸，其體內(nèi)半衰期非常短，只有2～3min，研究發(fā)現(xiàn)，通過將第8位的D-色氨酸用L-色氨酸取代可以增加作用時間，延長其體內(nèi)半衰期[15]。

除一般氨基酸取代策略，將非天然氨基酸引進(jìn)蛋白多肽類藥物中也可以增加此類藥物的穩(wěn)定性、延長半衰期，目前已研究出多種將非天然氨基酸引入蛋白多肽中的方法[16-17]。促性腺素釋放激素（GnRH）本身的血漿半衰期非常短，而合成的十肽GnRH拮抗劑（西曲瑞克、地加瑞克、阿巴瑞克）和GnRH激動劑（曲普瑞林、亮丙瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、那法瑞林）均含有非天然氨基酸，與GnRH相比均表現(xiàn)出延長的半衰期[18]。同時，引入非天然氨基酸還可提高肽的親和力[19]。目前，已有多種治療性多肽通過氨基酸替代有效延長了體內(nèi)半衰期（見表1）。

非天然氨基酸取代策略的一個主要問題是非天然氨基酸的潛在毒性。例如，具有非天然氨基酸取代的GnRH類似物與患者的藥物不良反應(yīng)相關(guān)[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，非天然氨基酸會在肝臟及其他器官中積聚[21]。

2.2 定點(diǎn)修飾突變

突變蛋白分子的特定位點(diǎn)，也能夠改善其穩(wěn)定性并延長蛋白多肽類藥物的血漿半衰期。如人胰島素，將A鏈第21位的天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?，在B鏈C端第30位加入2個精氨酸，得到的突變體在體內(nèi)能持續(xù)釋放且血藥濃度保持恒定，長達(dá)24h[22]?？怪屏鏊豈（OSM）是一種相對分子質(zhì)量為28000的可溶性細(xì)胞因子，由活化的免疫細(xì)胞分泌，越來越多的證據(jù)表明，OSM在炎癥中起著關(guān)鍵作用。CNTO8212是抗OSM IgG1單克隆抗體Fc區(qū)突變體，藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，CNTO8212具有較低的全身清除率和較長的食蟹猴體內(nèi)終末半衰期，預(yù)測的人藥動學(xué)參數(shù)提示CNTO8212可在臨床中以較低頻率給藥[23]。

2.3 通過基因手段與其他蛋白融合

融合蛋白與蛋白多肽類藥物基因融合表達(dá)，能夠增加藥物的相對分子質(zhì)量，降低體內(nèi)腎清除率，可達(dá)到延長藥物體內(nèi)半衰期的目的。FcIII是一種13-mer IgGFc結(jié)構(gòu)域結(jié)合肽（IgGBP），通過融合蛋白結(jié)合血清IgG來增加蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期，其與未融合修飾的蛋白質(zhì)相比，半衰期增加了75倍[24]。IgG1Fc片段非糖基化單鏈與干擾素-α（IFN-α）融合后得到IFN-α/Fc-MD，與商業(yè)聚乙二醇化IFN-α（PEG-IFN-α）進(jìn)行比較，IFN-α/Fc-MD顯示出與PEG-IFN-α相當(dāng)?shù)目共《净钚?。體內(nèi)藥動學(xué)測定顯示，IFN-α/Fc-MD在SD大鼠中具有比PEG-IFN-α更長的半衰期[25]。水蛭素與白蛋白融合后，藥物體內(nèi)作用時間延長，且其生物學(xué)活性也得到增強(qiáng)[26]。艾塞那肽被廣泛用于治療2型糖尿病，將艾塞那肽與人血清白蛋白（HSA）結(jié)合得到的融合肽顯示出與天然艾塞那肽類似的促胰島素分泌活性。皮下給藥后艾塞那肽-HSA的藥動學(xué)分析顯示，其與艾塞那肽相比，血漿半衰期延長了4倍。此外，艾塞那肽-HSA在口服葡糖糖耐量試驗中顯示出顯著改善的抗高血糖作用且增強(qiáng)了降血糖作用[27]。通過基因融合技術(shù)提高蛋白多肽類藥物穩(wěn)定性，是目前蛋白多肽類藥物長效化的良好途徑，其中不少融合蛋白藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)上市（見表2），同時也有相當(dāng)多的融合蛋白藥物處于臨床在研階段（見表3）。

表1 幾種通過氨基酸替代延長治療性多肽半衰期的藥物Table 1 Several therapeutic polypeptide drugs with prolonged half-life through amino acid substitutions

表2 近年獲批上市的融合蛋白藥物Table 2 Fusion protein drugs approved in recent years

表3 臨床在研的融合蛋白藥物Table 3 Fusion protein drugs in clinical trials

2.4 糖基化

糖基化通常發(fā)生在核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子中，在炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過程中發(fā)揮著重要作用。許多治療性蛋白多肽類藥物在體外進(jìn)行糖基化后，其藥動學(xué)和藥效學(xué)特性可獲得改善，此外，使用酶促或化學(xué)綴合方法的聚糖修飾還可促進(jìn)蛋白質(zhì)靶向疾病影響的組織[28]。研究發(fā)現(xiàn)，對重組α-1抗胰蛋白酶（rA1AT）柔性N-末端區(qū)域進(jìn)行N-糖基化修飾后，增加了rA1AT的循環(huán)半衰期，同時未改變其蛋白酶抑制活性[29]。特異性血管活性腸多肽受體2激動劑（BAY55-9837）作為2型糖尿病的潛在蛋白質(zhì)治療劑，穩(wěn)定性較差，體內(nèi)半衰期較短，而將其與殼聚糖修飾的硒納米顆粒（CS-SeNP）結(jié)合后得到的BAY-CS-SeNPs具有良好的穩(wěn)定性，釋放過程持續(xù)超過70h，累積釋放達(dá)到78.9%。此外，CS-SeNP與BAY55-9837綴合后，藥物的腎清除率顯著降低，且半衰期延長至20.81h[30]。

2.5 環(huán)化

線性肽在治療上受到代謝和構(gòu)象穩(wěn)定性差等因素的限制，可能損害其生物活性并影響半衰期，而環(huán)肽可以克服這些挑戰(zhàn)，因為它們更能抵抗代謝降解且能被設(shè)計成所需要的構(gòu)象。通過環(huán)化使多肽類藥物獲得穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，是延長血漿半衰期的一種有效途徑[31]。環(huán)化法能夠消除多肽鏈中帶電荷的末端，防止氨基酸的酶解，改善藥物代謝穩(wěn)定性、膜滲透性甚至提高口服生物利用度[32]。奧曲肽是天然生長抑素的環(huán)狀八聚體合成類似物，其保留了生長抑素的關(guān)鍵Phe-Trp-Lys-Thr部分（含有色氨酸殘基），與生長抑素藥理作用相似，但作用持續(xù)時間更長，在很大程度上延長了體內(nèi)消除半衰期[33]。普卡那肽（plecanatide）是含有16個氨基酸的環(huán)狀多肽，2017年經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，商品名為Trulance，給藥方式為口服，用于治療成人慢性特發(fā)性便秘[34]。目前，鑒于環(huán)化法的優(yōu)點(diǎn)，此種方法已被廣泛應(yīng)用于制備口服腸道多肽藥物，提高藥物的生物利用度[35]。環(huán)狀肽還可與具有高親和力和選擇性的蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合，用于診斷或治療，目前已從天然來源如細(xì)菌、真菌、植物和動物中分離出針對多種蛋白質(zhì)靶標(biāo)的環(huán)肽配體[36]。

2.6 與聚合物綴合

2.6.1 PEG化學(xué)修飾化學(xué)修飾是蛋白多肽類藥物常用的一種長效化技術(shù)，修飾的常用方法包括N-乙?；虲-酰胺化[37]，氨基酸鏈中氨基和/或羧基末端的化學(xué)修飾可以增強(qiáng)敏感蛋白多肽對蛋白水解酶的穩(wěn)定性。例如BAX855[PEG-重組凝血因子Ⅷ（rFVIII）]，rFVIII經(jīng)聚乙二醇修飾后，可以減少注射頻次，同時也保留了FVIII分子的功效[38]。TP508是一種合成衍生的組織修復(fù)肽，在治療糖尿病足潰瘍的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中表現(xiàn)出較好的安全性和潛在的功效，但TP508體內(nèi)半衰期短，研究人員嘗試將各種大小的聚乙二醇與TP508的N-末端或內(nèi)部半胱氨酸上進(jìn)行共價連接，評估后發(fā)現(xiàn)，PEG30k-TP508血漿半衰期相比于TP508延長約19倍，同時還顯示出增強(qiáng)的生物活性[39]。對原藥N端氨基進(jìn)行修飾目前已被廣泛應(yīng)用于多肽蛋白類藥物的商業(yè)化長效技術(shù)，例如PEG化粒細(xì)胞集落刺激因子（PEGG-CSF）和PEG化白細(xì)胞介素-10（PEG-IL-10）早在2006年已申請美國專利，目前也已經(jīng)有多種PEG化藥物被批準(zhǔn)上市（見表4）。

表4 近年來上市的PEG化長效蛋白多肽藥物Table 4 Recently approved long-acting PEGylated protein/peptide drugs

2.6.2 非結(jié)構(gòu)化可生物降解蛋白綴合除PEG外，非結(jié)構(gòu)化可生物降解蛋白（XTEN）修飾也能夠延長治療性蛋白多肽的半衰期。XTEN是非結(jié)構(gòu)化的非重復(fù)蛋白質(zhì)聚合物，目標(biāo)治療性分子可以與XTEN化學(xué)綴合，旨在通過引入類似于PEG的膨脹效應(yīng)來延長藥物的體內(nèi)半衰期。例如，研究人員將一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒肽T-20（用于治療具有多藥耐藥性的HIV-1）與XTEN結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其消除半衰期為(55.7±17.7)h，幾乎是T-20半衰期的 20倍[40]。

2.6.3 PAS綴合開發(fā)出具有擴(kuò)展的流體動力學(xué)體積的構(gòu)象無序多肽鏈也是一種延長半衰期的方法，這種無序多肽鏈包含脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸，簡稱為PAS無序多肽鏈。PAS序列是親水的、不帶電荷的生物聚合物，在水性緩沖液中形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其生物物理特性與PEG非常相似，可以通過化學(xué)偶聯(lián)與具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽綴合，延長其血漿半衰期。此外，PAS可生物降解，避免了在器官中的積聚，在血清中較為穩(wěn)定，且在小鼠體內(nèi)很難產(chǎn)生毒性或免疫原性。PAS化已成功應(yīng)用于多種生物制劑包括細(xì)胞因子、生長因子、抗體片段、酶以及各種多肽，其優(yōu)勢在小鼠、猴等各種動物模型中均得到驗證[41]。

2.6.4 羥乙基化淀粉綴合阿那白滯素（Anakinra）是人IL-1受體拮抗劑，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但此藥半衰期較短，臨床應(yīng)用上需要每天注射，極大地降低了患者的順應(yīng)性，羥乙基化淀粉（HES）是一種淀粉聚合物，將Anakinra與HES綴合后，得到的復(fù)合物穩(wěn)定性增加，且藥動學(xué)結(jié)果顯示其體內(nèi)半衰期增加6.5倍，AUC增加65倍[42]。

2.7 釘合肽

釘合肽是近年來新出現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)肽，因其結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定而受到研究者的關(guān)注。釘合肽是將肽“釘”成α-螺旋形狀，獲得優(yōu)化的交聯(lián)化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過交聯(lián)“裝訂”賦予肽對蛋白水解降解的抗性并增強(qiáng)其半衰期。釘合肽代表了一種有前途的新方法，可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用，并提供了瞄準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的機(jī)會。LaBelle等[43]基于BIM BH3螺旋模型設(shè)計了碳?xì)浠衔镝敽想?，其可廣泛靶向Bcl-2家族蛋白，從而觸發(fā)促凋亡活性。ALRN-5281是第一個長效人生長激素釋放激素（GHRH）激動劑釘合肽藥物，自2013年1月開始進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗[44]。研究證明，碳?xì)浠衔镝敽夕?螺旋肽已成為一類新的肽治療劑[45-46]，此類釘合肽具有穩(wěn)定的構(gòu)象，能夠提高藥物的體內(nèi)生物利用度[47]。

2.8 藥物傳遞系統(tǒng)開發(fā)

注射劑進(jìn)入體內(nèi)后起效快、體內(nèi)分布迅速、生物利用度高，但面臨著患者依從性差、給藥不方便、生產(chǎn)成本高以及使用風(fēng)險高的問題，因此，研究者也在致力于開發(fā)注射劑藥物傳遞系統(tǒng)（DDS），以期將藥物在一定時間內(nèi)遞送到特定部位發(fā)揮療效，這種系統(tǒng)能夠通過制劑的手段提高藥物靶向功效、降低藥物的毒副作用[48-49]。Zoladex是已上市多肽植入劑的代表，活性成分是醋酸戈舍瑞林，用于治療前列腺癌及乳腺癌，可直接注射于皮下或肌內(nèi)，與其他類型的植入劑相比，無需通過手術(shù)取出基質(zhì)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）可自行在體內(nèi)降解，從而減少了藥物不良反應(yīng)。采用PLGA或聚乳酸（PLA）為骨架材料，包裹藥物制成注射微球，在體內(nèi)也可達(dá)到緩釋的目的，并且PLGA和PLA是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的生物材料，可在體內(nèi)降解。第1個多肽注射微球產(chǎn)品是曲普瑞林PLGA微球，由法國Ipsen公司開發(fā)，于1986年上市，可緩釋1個月，近年來也有多種長效化緩釋微球被批準(zhǔn)上市（見表5）。脂質(zhì)雙層和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，因此脂質(zhì)體可以有效地滲透細(xì)胞膜以釋放藥物，而且脂質(zhì)體可生物降解、基本無毒，可以包封親水和疏水材料，在藥物遞送系統(tǒng)中用作藥物載體，體內(nèi)相容性和安全性均較好。例如米伐木肽脂質(zhì)體注射劑，于2009年上市，給藥周期為每周2次，治療3個月，隨后每周1次，治療6個月，用于治療非轉(zhuǎn)移性可切除的骨肉瘤。

3 結(jié)語

目前，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向蛋白多肽類藥物，此類藥物的研發(fā)和上市也呈現(xiàn)出逐步加速的趨勢，占據(jù)的市場份額也越來越大。一方面，大約80%的蛋白多肽藥通過注射途徑給藥，另一方面，作為長效化技術(shù)手段，PEG化和融合蛋白技術(shù)在蛋白多肽類藥物中的應(yīng)用較為成熟和普遍，而隨著生物技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)其他劑型及給藥途徑也日益受到關(guān)注，如DDS。Midasol Therapeutics公司利用胰島素糖基化納米粒子開發(fā)的經(jīng)口腔遞送系統(tǒng)，以及ActoGeniX公司開發(fā)的TopAct技術(shù)平臺，以期用口服給藥替代注射給藥途徑。研究人員開發(fā)了各類藥物傳遞系統(tǒng)，目的是通過載體控制藥物的釋放、提高藥物的穩(wěn)定性，另外還能提高難溶藥物的溶解性、靶向性。目前開發(fā)的DDS主要有植入劑、微球注射劑、脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑等，預(yù)示著未來緩釋、控釋和納米制劑等有非常好的前景?？梢韵嘈牛磥砣藗冞€會不斷尋求新的長效化手段，研發(fā)出活性更好且更加長效的蛋白多肽類藥物，為現(xiàn)有長效技術(shù)錦上添花，為廣大患者造福。