王風波，魏曉霏，王科，唐明薇

（成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 康復醫(yī)學科，四川 成都 610500）

2型 糖 尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）認知功能受損如未得到有效干預，可逐漸演變?yōu)槿烁窀淖兒蜕罨顒幽芰θ笔В踔涟V呆癥[1]。研究證實，T2DM可導致腦組織神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）缺失[2]。高壓氧療法廣泛應用于各種腦損傷，但目前尚未查及國內(nèi)外高壓氧對T2DM認知功能及腦組織NGF影響作用的相關報道。本研究首次采用高壓氧對T2DM大鼠進行治療性干預，旨在探討T2DM腦組織中NGF microRNA（NGF mRNA）表達與認知功能的關系，為高壓氧治療T2DM腦病提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48只健康成年SD大鼠，體重240～280 g，由成都醫(yī)學院動物實驗中心提供，許可證號：SYXK（川）2015-196，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組（12只）、T2DM模型組（36只）。模型復制成功后，T2DM模型組大鼠再次按隨機數(shù)字表法分為非干預A組（6只）、非干預B組（12只），以及高壓氧A組（6只）、高壓氧B組（12只）。注射鏈脲佐菌素10 d后，非干預A組、高壓氧A組大鼠行Morris水迷宮實驗檢測認知功能；空白對照組、非干預B組、高壓氧B組各隨機取6只 大鼠腦組織檢測NGF mRNA。高壓氧療程結束，非干預A組、高壓氧A組再次行認知功能測驗；空白對照組、非干預B組、高壓氧B組檢測NGF mRNA。

1.2 材料及主要設備

Trizol、DEPC及逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）,實驗小動物高壓氧艙（煙臺宏遠氧業(yè)有限公司G2-Y900-002型），Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（上海吉量科技有限公司）。

1.3 T2DM模型復制

T2DM模型組大鼠置于（25±2）℃室溫適應性飼養(yǎng)1周，測得尾靜脈血空腹血糖≤5.5 mmol/L，復制T2DM大鼠模型[3]：高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周，禁食、不禁水12 h，經(jīng)腹腔單次注入1%鏈脲佐菌素（35 mg/kg），3 d后測得尾靜脈隨機血糖≥16.7 mmol/L，確定模型復制成功。

1.4 高壓氧治療

注射后15 d開始，每天定時將高壓氧A、B組大鼠置入高壓氧艙，純氧洗艙10 min后設置20 min內(nèi)勻速加壓至2.5個絕對大氣壓，穩(wěn)壓吸純氧40 min，20 min勻速減壓出艙，1次/d，共20 d[4]?？瞻讓φ战M及非干預A、B組大鼠不予任何干預。

1.5 Morris水迷宮認知功能測驗

Morris水迷宮認知功能測驗包括：①定位航行實驗。大鼠先連續(xù)訓練3 d，3次/d，平臺保持固定位置，訓練結束次日記錄大鼠120 s內(nèi)從入水到爬上平臺所花費的時間，為逃避潛伏期；②空間探索實驗。第 5天去除平臺，隨機選擇訓練象限，將大鼠面壁置入水池，記錄大鼠120 s內(nèi)自由穿越虛擬平臺的次數(shù)。定位航行考察大鼠學習能力，空間探索考察大鼠空間記憶 能力[5]。

1.6 腦組織NGF mRNA檢測

參考文獻[6]及試劑盒說明書，采用RT-PCR檢測大鼠腦組織NGF mRNA。大鼠麻醉后處死取腦組織，采用Trizol法提取總RNA逆轉錄為cDNA。NGF正 向 引 物：5’-GCTGCACGTAGCCACCGGAC-3’，反 向 引 物：5’-GCAGCTAGTGCTGCCGTCTA-3’；β-actin為內(nèi)參定量分析NGF mRNA，β-actin正向引物：5’-GCGTGATCGCTGCGAGAC-3′，反向引物：5’-CCGCGGTCGCACTCGATAC-3’。PCR反應結束，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般及血糖情況

T2DM模型大鼠反應變慢，皮毛光澤下降，出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，消瘦、精神狀態(tài)變差等，高壓氧治療后，大鼠上述癥狀有所改善。

2.2 高壓氧A組與非干預A組大鼠認知功能比較

高壓氧治療20 d后，高壓氧A組與非干預A組逃避潛伏期比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高壓氧A組較短；高壓氧A組與非干預A組穿越虛擬平臺次數(shù)比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高壓氧A組次數(shù)較多。見表1。

表1 兩組大鼠逃避潛伏期、穿越虛擬平臺次數(shù)比較（n=6，±s）

表1 兩組大鼠逃避潛伏期、穿越虛擬平臺次數(shù)比較（n=6，±s）

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2.3 各組大鼠腦組織NGF mRNA水平比較

治療前，空白對照組、非干預B組、高壓氧B組腦組織NGF mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，非干預B組、高壓氧B組低于空白對照組（P＜0.05）。高壓氧治療20 d后，空白對照組、非干預B組、高壓氧B組腦組織NGF mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，高壓氧B組高于非干預B組和空白對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠腦組織NGF mRNA水平比較 （n=6，±s）

表2 3組大鼠腦組織NGF mRNA水平比較 （n=6，±s）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與非干預B組比較，P＜0.05

組別 治療前 治療20 d空白對照組 0.93±0.47 0.97±0.14非干預B組 0.31±0.641） 0.29±0.87高壓氧B組 0.34±0.591） 0.78±0.612）F值 41.639 35.258 P值 0.000 0.000

3 討論

大量研究證實，糖尿病患者是血管性癡呆和阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）的高危人群，主要表現(xiàn)為學習、記憶、思維、邏輯等能力衰退，T2DM是主要的糖尿病類型，隨著病情發(fā)展，患者可出現(xiàn)行為異常，甚至喪失社會參與能力[7]。本實驗采用高糖高脂+鏈脲佐菌素腹腔注射復制T2DM大鼠模型，模擬人類T2DM發(fā)病進程。Morris水迷宮測驗顯示，T2DM模型大鼠學習記憶能力明顯下降，腦組織NGF mRNA表達水平下降，提示模型復制成功。結果顯示，經(jīng)過20 d高壓氧治療，大鼠血糖降低，糖尿病癥狀改善，逃避潛伏期縮短，穿越虛擬平臺次數(shù)增多，較非干預組明顯改善，說明高壓氧對T2DM認知功能障礙的康復起積極作用。其機制可能為[8-9]：①調(diào)節(jié)機體糖脂代謝，改善腦組織微循環(huán)及細胞代謝，有利于腦高級功能恢復；②提高腦組織氧自由基清除能力，抑制炎癥反應，改善腦細胞腫脹變性；③調(diào)節(jié)神經(jīng)活性物質表達水平，促進腦細胞及髓鞘的修復；④提高機體氧化應激，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制細胞凋亡。

NGF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。近年來研究證實，缺血性和出血性腦損傷的腦組織NGF陽性表達增強，NGF mRNA表達上調(diào)，有利于防止神經(jīng)元死亡，改善神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化，促進神經(jīng)系統(tǒng)的再生與修復[10-11]。AD模型大鼠接受NGF移植入海馬區(qū)，其神經(jīng)行為學得到顯著提高[12]。近年來高壓氧治療糖尿病并發(fā)癥獲得較好療效，有報道稱連續(xù)40 d高壓氧治療后，糖尿病周圍神經(jīng)病變患者四肢疼痛癥狀緩解，肢體運動及感覺神經(jīng)傳導速度改善優(yōu)于對照組[13]。糖尿病足患者經(jīng)高壓氧治療后創(chuàng)面愈合情況明顯改善，血清血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子水平升高[13]。本實驗結果顯示，T2DM模型大鼠NGF mRNA表達水平低于空白對照組，說明T2DM可顯著降低腦組織NGF的合成。參照人類高壓氧治療模式，對T2DM大鼠進行2個療程共20 d的高壓氧治療，治療結束后大鼠腦組織NGF mRNA表達水平高于非干預組，說明高壓氧療法可促進腦組織NGF合成、代謝，提高表達水平，有利于腦細胞及神經(jīng)軸突的損傷后修復，進而改善學習、記憶等認知功能。NGF對腦高級功能的積極作用可能與其特有的神經(jīng)保護生物活性有關，如抑制超氧自由基、毒性氨基酸的釋放及腦細胞凋亡等[14-15]。盡管糖尿病認知功能障礙越來越受到學者及醫(yī)務工作者的重視，但目前治療方式仍較局限，主要依靠藥物及認知訓練、作業(yè)療法等康復治療技術。高壓氧療法能否作為常規(guī)治療手段長期介入，本研究或許能提供較堅實的實驗基礎及理論依據(jù)。