陳祝鋒 王曉艷

作者單位：710038 西安，中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科(陳祝鋒)；150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬 醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(王曉艷)

有研究證實(shí) Th17 細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者的滑膜炎癥中發(fā)揮著重要作用[1]。目前發(fā)現(xiàn)，DDX5 和 lncRMRP 作為 ROR γt 的新型配體，在誘導(dǎo) Th17 細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要作 用[2]。DDX5 屬于 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)box 蛋白家族成員，是一類進(jìn)化高度保守的 ATP 依賴 RNA 解旋酶，參與 RNA 合成、剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)各個(gè)方面。新近的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中存在 DDX5 表達(dá)上調(diào)，通過(guò)抑制其表達(dá)后可減少腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[3-10]，然而 DDX5 在 RA 中的研究暫無(wú)報(bào)道，因此本研究擬探討 DDX5 在 RA 滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

材料與方法

一、材料

siRNA、轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣東銳博生物技術(shù)有限公司；四季青胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司(11011-8611)；TRIZOL 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司(15596026)；青霉素溶液－鏈霉素溶液(碧云天公司 C0222)、胰蛋白酶購(gòu)自碧云天公司(C0201)；DMEM / F12 購(gòu)自美國(guó) HyClone 公司(AC10447353)；引物由哈爾濱欣科瑞公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 abm 公司(G492)，SYBR Green PCR 試劑盒購(gòu)自 abm 公司(MasterMix-S)；Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(C1063)；I型膠原酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司(C0130)；CCK8 試劑盒購(gòu)自 MEC 公司(HY-K0301)。倒置顯微鏡(蔡司 Primovert Hdcam)； Real-time PCR 儀(Rotor Gene Q2 plex)；PCR 擴(kuò)增儀(Bio-radPIC-2005)、流式細(xì)胞儀(貝克曼 Epics XL-MCL)；細(xì)胞孵箱、超凈工作臺(tái)(美國(guó) Thermo公司)；高速低溫離心機(jī)(貝克曼 GS-15R)；酶標(biāo)儀(帝肯 Infinite M200 Pro)；培養(yǎng)瓶(美國(guó) Corning 公司，430639)。

二、方法

1. 滑膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：取行關(guān)節(jié)置換術(shù)的 RA 患者的滑膜組織，放入含 1% 雙抗的 PBS 冰水中清洗 2 次，用解剖剪仔細(xì)剔除脂肪組織，然后將組織放入含有 4 mg / ml I 型膠原酶的 DMEM / F12 中，將組織剪成 1 mm3的碎片，然后轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管，37 ℃ 孵育 120 min(每隔 15 min 搖晃幾次)，細(xì)胞懸液經(jīng) 70 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，離心半徑 7.5 cm，1000 r / min，離心 5 min，DMEM / F12 洗滌 2 次，細(xì)胞最終懸浮于含 10% 胎牛血清，1% 青霉素鏈霉素溶液的 DMEM / F12 中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每隔 3～5 天換液 1 次，第 3～6 代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

2. RT-qPCR：收取行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)中取下的 RA 患者滑膜組織(8 例)及行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的半月板損傷患者的滑膜組織做對(duì)照(3 例)，迅速放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室。用液氮研磨滑膜組織，Trizol 法提取總 RNA，比色杯測(cè) RNA 濃度，用 2 μl RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄 20 μl 體系：RNA Template 2 μg， AccuRT Reaction Mix(4X)2 μg，Nucleose-free H2O up to a total volume of 8 μl，室溫放置 5 min，AccuRT Reaction Stopper(5X)2 μl，5X All-In-One RT MasterMix 4 μl，Nuclease-free H2O 6 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15min，85 ℃ 5 min。PCR 反應(yīng)體系：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μl，F(xiàn)orward Primer(10 μM)0.3 μl，Reverse Primer(10 μM)0.3 μl，Template DNA＜＝500 ng / reaction，Nuclease-free H2O to 10 μl，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，40 cycles。采用 2-△△CT法，設(shè)對(duì)照組表達(dá)為 1，算出 fold change。引物序列：GAPDH，forward：5’-GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT-3’，reverse：5’-GGCTGTT GTCATACTTCTCATGG-3’；DDX5，forward：5’-GC ACAGCACAAGAGGTGGAA-3’，reverse：5’-TCCCT GAGCTTGAATAGCAGT-3’。

3. siRNA 轉(zhuǎn)染：用廣東銳博生物的轉(zhuǎn)染試劑盒(R0510)，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，應(yīng)用 1× riboFECTTM CP Buffer 稀釋 siRNA，混勻加入 3 μl riboFECTTM CP Reagent，制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育 10 min，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入適量無(wú)雙抗完全培養(yǎng)基中混勻，將培養(yǎng)版放置 37 ℃ 孵箱培養(yǎng) 24～72 h。

4. CCK8 測(cè)定細(xì)胞活性：將細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×105/ ml，每孔 100 μl 接種于 96 孔板上，siCtrl 組和 siDDX5 組分別加入不同 siRNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每組設(shè) 6 個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24～72 h，加人 CCK8 10 μl，放置于孵箱內(nèi)培養(yǎng) 2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm處的吸光度值(OD450)。

5. 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡：取轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞，將培養(yǎng)液吸出至 15 ml 離心管內(nèi)，PBS 洗滌 1 次，然后加用 0.25% 胰酶消化 2 min，加入原培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞輕輕吹下，收集至 15 ml 離心管內(nèi)離心(離心半徑 7.5 cm，1000 r / min，離心 5 min)，棄上清，加入 PBS，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 1×l06/ ml，取 1 ml 細(xì)胞懸液 1000 r / min 離心 5 min，棄上清，加入 5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育 10 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn) α＝0.05，統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RA 與正常對(duì)照組滑膜中 DDX5 的表達(dá)

設(shè)正常對(duì)照組表達(dá)為 1，RA 組滑膜組織中 DDX5 mRNA 的表達(dá)為 1.61±0.63，P＜0.05，t＝4.56(圖 1)。

二、轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖情況

CCK8 檢測(cè) RA 滑膜成纖維細(xì)胞的活性顯示，轉(zhuǎn)染 siCtrl 后，24 h，48 h，72 h OD450 分別為 ( 0.71±0.008，0.83±0.02，0.89±0.009)，轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，24 h，48 h，72 h OD450 分別為(0.7± 0.02，0.79±0.01，0.81±0.02)，結(jié)果顯示 72 h 兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，t＝5.5)(圖 2)。

圖1 RA 與正常對(duì)照組滑膜中 DDX5 的表達(dá)Fig.1 The expression of DNM1L in synovial tissues of RA and normal control

圖2 轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖情況Fig.2 The expression of DNM1L in synovial tissues of RA and normal control

三、轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細(xì)胞凋亡情況

Annexin V-FITC 檢測(cè) RA 滑膜成纖維細(xì)胞凋亡顯示，轉(zhuǎn)染 siCtrl 72 h 后，凋亡細(xì)胞比率為(13.4± 1.44)%，轉(zhuǎn)染 siDDX5 72 h 后，凋亡細(xì)胞比率為(21.7±2.12)，P＜0.05，t＝5.35(圖 3)。

討 論

RA 主要病理改變?yōu)榛ぱ祝そM織增生，滑膜細(xì)胞包括滑膜成纖維細(xì)胞和滑膜巨噬細(xì)胞，滑膜成纖維細(xì)胞在滑膜細(xì)胞增殖、遷移以及促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。眾所周知，Th17 細(xì)胞在 RA 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，通過(guò)阻斷 Th17 細(xì)胞的作用有望達(dá)到治療疾病的目的。在誘導(dǎo) Th17 細(xì)胞成熟的過(guò)程中，ROR-γt 扮演了重要作用。ROR-γt 的兩個(gè)配偶體：DDX5 和 lncRMRP 的共同協(xié)作，控制了 Th17 細(xì)胞的成熟，DDX5 可以促進(jìn) RMRP 改變形狀并且吸附至 ROR-γt 上，從而形成一種復(fù)合體吸附到靶點(diǎn)位置上促進(jìn)基因的開(kāi)啟。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這種機(jī)制不存在時(shí)，患自身免疫疾病的小鼠模型(EAE)疾病減輕[2]。

DDX5 在多種腫瘤中高表達(dá)。Xue 等[3]的研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中 DDX5 表達(dá)增高，抑制其表達(dá)后肝癌細(xì)胞增殖遷移降低，凋亡增加。有研究表明，DDX5 通過(guò) mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[10]。此外，DDX5 通過(guò) beta-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖[5]。乳腺癌中，DDX5 高表達(dá)，通過(guò)增加促癌表達(dá)加重疾病進(jìn)展[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用白藜蘆醇(resveratrol)后，可通過(guò)減少 DDX5 產(chǎn)生，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[8]。同時(shí)，DDX5 在食管癌中表達(dá)增高，阻斷 DDX5 表達(dá)后可抑制食管癌細(xì)胞增殖和遷移[6]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn) DDX5 可通過(guò)減少病毒正鏈 RNA 的負(fù)鏈合成來(lái)增強(qiáng)丙型肝炎病毒(HCV)病毒復(fù)制[12]。最近報(bào)道指出，DDX5 以 stat3 依賴性方式增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲[9]?？梢?jiàn)，在腫瘤中，DDX5 可作為有效的治療靶點(diǎn)緩解多種腫瘤疾病的進(jìn)展，然而關(guān)于其在自身免疫性疾病中的作用仍未可知。

圖3 轉(zhuǎn)染 siDDX5 后，RA 滑膜成纖維細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis after the transfection of siDDX5

本研究結(jié)果顯示與腫瘤一樣，RA 滑膜組織同樣存在 DDX5 表達(dá)增多現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究 DDX5 對(duì) RA 滑膜成纖維細(xì)胞的影響，本研究應(yīng)用小干擾 RNA 轉(zhuǎn)染滑膜成纖維細(xì)胞，并進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果顯示沉默 DDX5 表達(dá)后，RA 滑膜成纖維細(xì)胞增殖減低，且凋亡增加。提示 DDX5 可能參與了 RA 滑膜炎的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)抑制 DDX5 的表達(dá)，有望達(dá)到治療 RA 的目的。然而關(guān)于 DDX5 對(duì) RA 局部炎癥因子及信號(hào)通路的影響以及對(duì)關(guān)節(jié)炎模型疾病的影響，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次證實(shí)，通過(guò)阻斷 RA 滑膜局部 DDX5 的表達(dá)，有望達(dá)到治療 RA 的目的。