李虎 李儒軍 陶可 趙丹 張立毅 高嘉翔 柯巖 林劍浩

作者單位：100044 北京大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科、關(guān)節(jié)炎診療中心(李虎、李儒軍、陶可、張立毅、高嘉翔、柯巖、林劍 浩)；100871 北京大學(xué)工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系(趙丹)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondyliti，AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)炎、肌腱端炎和脊柱炎為特點(diǎn)的慢性進(jìn)行性全身結(jié)締組織疾病，是其它脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthritis，SpA)的原型。AS 好發(fā)于青壯年男性，國內(nèi) AS 發(fā)病率為 0.23%。由于本病病因尚未完全明確，起病隱匿，病程遷延，早期臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏特異性，晚期病情嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)脊柱強(qiáng)直、關(guān)節(jié)畸形后，病情不能扭轉(zhuǎn)，可導(dǎo)致功能喪失，是青壯年致殘的主要原因。以往研究證實(shí)肌腱附著點(diǎn)異常骨化是其病變基礎(chǔ)，而成纖維細(xì)胞在致炎性因子作用下的成骨轉(zhuǎn)化在 AS 病理性骨化鈣化發(fā)病、進(jìn)展過程中起重要作用[1-6]。

趨化素樣因子 1(chemokine-like factor1，CKLF1)是北京大學(xué)人類基因研究中心利用差異性遞減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)，在國際上克隆 U937 細(xì)胞中被植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激并被白細(xì)胞介素(IL)-10 抑制的 cDNA 中，首次發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，具有 CC 家族趨化因子的結(jié)構(gòu)特征和功能特征[7]。體內(nèi)外的研究均證實(shí)，CKLF1 可以明顯激活并趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞[7]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis，RA)滑膜中 CKLF1 表達(dá)水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和半月板損傷的 CKLF1 水平，提示其在 RA 發(fā)病中可能起到重要作用。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)[9]，AS 患者髖關(guān)節(jié)囊滑膜組織中 CKLF1 及其受體 CCR4 表達(dá)明顯升高，且與體內(nèi) C 反應(yīng)蛋白、血沉和 D-二聚體等水平存在一定正相關(guān)性，表明 CKLF1 在 AS 病變中可能也發(fā)揮重要作用。最新研究還發(fā)現(xiàn)[10]，CKLF1 基因過表達(dá)能促進(jìn) AS 髖關(guān)節(jié)囊周圍滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和致炎性細(xì)胞因子分泌，并增強(qiáng)成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，推測 CKLF1 可能在 AS 關(guān)節(jié)病理性骨化過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討 CKLF1 對 AS 髖關(guān)節(jié)囊另一種參與病理性骨性強(qiáng)直的重要的細(xì)胞成分即滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，以明確其在 AS 發(fā)病過程中的可能作用機(jī)制并為探尋 AS 新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)液、Opti-MEMTM、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶＋0.02% EDTA、磷酸鹽緩沖液(PBS)等試劑均購于 Gibco 公司，pCDI-CKLF1 和兔抗人 CKLF1 多克隆抗體(北京大學(xué)人類疾病基因研究中心韓文玲、陳英玉和馬大龍教授饋贈(zèng))，人胚胎腎 293T 細(xì)胞、AAV-2 質(zhì)粒(pACP)、Ad5 和 Ad8 腺病毒等為本實(shí)驗(yàn)室保存，II 型膠原酶、HEPES(Sigma 公司)，限制性內(nèi)切酶 Xbal、BamHl、EcoRI 和 T4 DNA 連接酶等(Rothe 公司)，WST-1 細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Rothe 公司)，白細(xì)胞介素(IL)-6 和腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(RD 公司)，一抗(除 CKLF1 外)均來自于 Abcam 公司，H & E 染液(Rothe 公司)，Trizol 細(xì)胞裂解液(Invitrogen 公司)，熒光定量 RT-PCR(fluorescence quantitative RT-PCR，F(xiàn)Q-PCR)試劑盒(Invitrogen 公司)，Rhodamine 標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(Sigma 公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司)，F(xiàn)Q-PCR 反應(yīng)儀(ABI 公司)，激光共聚焦顯微鏡(Confocal，Olympus 公司)。

二、倫理審批

本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會遞交倫理審查批準(zhǔn)所有參與的患者均簽署知情同意書。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均嚴(yán)格遵從赫爾辛基宣言等，保護(hù)受試者權(quán)益；實(shí)驗(yàn)后，嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)室生化試劑使用后的無害化處理原則及按照醫(yī)院醫(yī)療廢物處理規(guī)章制度處理實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本。

三、髖關(guān)節(jié)滑膜組織的獲取

本實(shí)驗(yàn)所需正常和 AS 人髖關(guān)節(jié)滑膜組織分別取自于我科 4 例臨床診斷為股骨頸骨折 [排除 OA、RA 和 AS 等疾病，平均年齡：( 63.75±3.49)歲，男] 和 3 例重度 AS(髖關(guān)節(jié)強(qiáng)直)[11][排除 OA、RA 等疾病，平均年齡：( 46.00±2.94)歲，男] 擬行髖關(guān)節(jié)置換的患者，兩組患者人口學(xué)資料相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

滑膜成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參考已建立的方法[9-10]。具體如下：無菌操作條件下，取新鮮獲取的髖關(guān)節(jié)囊周圍滑膜組織，PBS 沖洗至液體無色透明，眼科剪剔除周圍脂肪組織，剪碎后用 1 mg / ml II 型膠原酶消化過夜，離心去上清，加入 10% 胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素)重懸單細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞及存活率(＞95%)，分裝于 75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)后 24 h 首次更換培養(yǎng)基并去除未貼壁的細(xì)胞，以后每隔 3 天換液 1 次。采用倒置相差顯微鏡每天對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)用第 3～5 代細(xì)胞[12]。取上述第 3 代細(xì)胞，以 1×105/ 每孔接種于預(yù)置有蓋玻片(24 mm × 24 mm，經(jīng)多聚賴氨酸 / 甘油處理)的 6 孔板中，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。4% 的多聚甲醛固定后，依次經(jīng)過 0.25% Triton X-100 通透化、3% 的 BSA 封閉、抗 vimentin 抗體 4 ℃ 過夜和 Rhodamine 標(biāo)記的熒光二抗孵育后，將玻片置于 Confocal 顯微鏡下觀察、拍照分析。

五、髖關(guān)節(jié)滑膜組織原位和成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的構(gòu)建

首先，髖關(guān)節(jié)滑膜組織原位培養(yǎng)：按照已報(bào)道的髖關(guān)節(jié)滑膜組織原位培養(yǎng)模型[10]并借鑒 Riera 等[13]報(bào)道的人半月板原位培養(yǎng)模型進(jìn)行髖關(guān)節(jié)滑膜組織取材。具體方法為：采用直徑 2 mm 特制取材器對新鮮髖關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜組織進(jìn)行打孔取材，后將圓柱狀標(biāo)本(長 4 mm，直徑 2 mm)置入 24 孔板中并加入 10% 胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。其次，建立滑膜成纖維細(xì)胞體外(in vitro)2D 培養(yǎng)模型[9-10]：將上述經(jīng)鑒定的滑膜成纖維細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)后分別接種于 96 孔板(1×104/ 每孔)、預(yù)置有蓋玻片的 6 孔板和 75 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行 2D 平面培養(yǎng)。每 3 天更換 1 次組織和細(xì)胞的培養(yǎng)基。

六、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)-hCKLF1 載體的包裝與鑒定 [7,10,14-17]

首先，RT-PCR 獲取和擴(kuò)增人 CKLF1 cDNA；同時(shí)，pCDI-CKLF1 擴(kuò)增后進(jìn)行過夜(18 h)酶切(EcoRI 限制性內(nèi)切酶)和 0.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切情況。利用 DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，檢測分光光度值(OD 值)標(biāo)記濃度，比較兩種方法所得 CKLF1 基因一致性。其次，使用 T4 DNA 連接酶，將 CKLF1 基因插入表達(dá)載體 pACP(來源于 pSSV9，是 AAV-2 基因克隆之一)[14-16]，具體為：4 μl 純化 CKLF1 基因產(chǎn)物，1.6 μl 已酶切暴露黏性末端的表達(dá)載體 pACP，0.5 μl T4 DNA 連接酶，1.9 μl 10×ligation buffer，終體積 8 μl。16 ℃ 水浴過夜鏈接，70 ℃ 5 min 終止鏈接反應(yīng)，備用。再次，取 2 μl 上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，最后涂在含有 100 mg / ml 青霉素的 LB 平板上進(jìn)行篩選，平板置于 37 ℃ 孵箱過夜，觀察陽性克隆。無菌條件下，挑取單個(gè)陽性克隆菌落加入含 100 mg / ml 青霉素的 LB 培養(yǎng)基 5 ml 中，30 ℃、水平轉(zhuǎn)速為 150 rpm 的恒溫?fù)u床過夜，收集細(xì)菌并進(jìn)行質(zhì)粒提取(Rothe 質(zhì)粒提取試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作)，單、雙酶切法再次鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，并送公司測序。隨后，按照 Cucchiarini 等[16]已報(bào)道的方法，進(jìn)行重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體在 293T 細(xì)胞中的包裝和擴(kuò)增，具體為：在腺病毒 Ad5 和 Ad8 的輔助下，向 70%～80% 生長融合的 293T 細(xì)胞加入上述經(jīng)鑒定的 pACP 質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h 后更換一次含谷氨酰胺的胎牛血清培養(yǎng)基，24 h 后收集含 rAAV 載體的病毒粗提液。以 -80 ℃、37 ℃ 各 1 min 反復(fù)凍融 4 次，10000 rpm 超高速離心得病毒上清液，置于 -80 ℃，備用。同樣的方法構(gòu)建、包裝與鑒定 rAAV-lacZ 載體。最后，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID 50)測定病毒滴度：在 96 孔板中分 8 個(gè)病毒稀釋梯度 [10-3，10-4，-10-10，每個(gè)梯度 12 孔(一排)，其中前 2 孔為陰性對照]，加入到 2.5% 胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的 293T 細(xì)胞中，37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10 天。10 天后倒置顯微鏡下觀察，計(jì)算每一排中出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的孔數(shù)，根據(jù) TCID 50＝ 101+d (S-0.5)(d 為 log10稀釋倍數(shù)，S 為陽性孔比率總和)，最后將 TCID 50 轉(zhuǎn)換為空斑形成單位(PFU)/ ml，即：PFUs＝0.7×TCID 50 的滴度。

七、rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 [9-10,12]

將上述純化的含 rAAV-lacZ、rAAV-hCKLF1 病毒液分別加入上述髖關(guān)節(jié)滑膜組織(15 μl / 組織樣 本)和細(xì)胞模型(3 μl / 孔)，靜止 1 min，后加入無血清 DMEM 培養(yǎng)基，輕輕振蕩使病毒與組織塊或細(xì)胞充分接觸，1.5 h 后加入含 10 ng / ml BMP-2，10 mmol / L β-甘油磷酸鈉，50 mg / L 維生素 C， 100 mmol / L 地塞米松和 10% 胎牛血清的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至 21 天。本實(shí)驗(yàn)中 rAAV 病毒載體轉(zhuǎn)染效率的測定分別采用 X-gal 活組織染色和 Western blot 法檢測四種模型中 rAAV 病毒載體轉(zhuǎn)染效率。首先，X-gal 染色定性檢測 rAAV-lacZ 轉(zhuǎn)染結(jié)果，具體為：將上述模型中經(jīng) rAAV-lacZ 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞標(biāo)本用 2% 甲醛溶液固定后，加入新鮮配置的 X-gal 染液，于 30 min，1 h，2 h，光鏡下觀察并拍照，以隨機(jī) 10 個(gè)高倍鏡下的陽性細(xì)胞數(shù)(深藍(lán)色染色)/ 總細(xì)胞數(shù)× 100% 為陽性率，也即轉(zhuǎn)染效率。以上各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次。以上兩樣本實(shí)驗(yàn)均分為三組：無病毒轉(zhuǎn)染組(no vector)、rAAV-lacZ 轉(zhuǎn)染組(lacZ)和 rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染組(CKLF1)。

八、rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力檢測

rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染 21 天后，分別收集組織和細(xì)胞標(biāo)本，進(jìn)行如下操作：對組織切片行 HE 染色并計(jì)數(shù)單位面積下的細(xì)胞數(shù)[10,16]、水溶性四氮唑法(WST-1)檢測細(xì)胞增殖能力[9-10]和 Hoechst 33258 檢測細(xì)胞 DNA 含量[10,16]。

九、rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染后的致炎性細(xì)胞因子分泌

rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染第 20 天時(shí)，更換無血清 DMEM 培養(yǎng)基 100 μl / 孔，24 h 后收集培養(yǎng)體系中的上清液，移入無菌 Eppendorf 管中，置入 -80 ℃，備測。使用 IL-6 和 TNF-α ELISA 試劑盒分別檢測樣本中 IL-6 或 TNF-α 的相應(yīng)濃度[10,18]，進(jìn)而判斷 CKLF1 過表達(dá)對兩者分泌的影響。以上步驟重復(fù) 3 次，結(jié)果取平均值。

十、Confocal 掃描 rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染后對特異性成骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響 [10]

骨鈣蛋白(OCN)和骨橋蛋白(OPN)是重要的特異性骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，采用與上述判斷 vimentin 蛋白表達(dá)水平一樣的方法對樣本 OCN 和 OPN 進(jìn)行檢測。

十一、FQ-PCR 檢測成骨關(guān)鍵靶基因、CKLF1 及其受體 CCR4 的表達(dá)

使用熒光定量 RT-PCR(FQ-PCR)對 CKLF1 基因轉(zhuǎn)染后樣本的成骨關(guān)鍵靶基因以及 CKLF1 與其受體 CCR4 的表達(dá)進(jìn)行了定量分析(引物序列見表1)[10]。

由獲取的循環(huán)閾值(Ct)值，根據(jù) 2-△△Ct法(目的基因 mRNA 表達(dá)量＝2-△△Ct，△Ct＝△E－△C，△E＝Ct樣本－Ctβ-actin，△C＝Ct對照組－Ctβ-actin)分別計(jì)算目的基因 CKLF1、CCR4、ALP、Runx2、OPN、OCN和 Col1α2 在不同實(shí)驗(yàn)分組中的表達(dá)量[9-10,18]。

表1 目的基因序列及擴(kuò)增產(chǎn)物、退火溫度、循環(huán)次數(shù)Tab.1 Target gene sequence and amplification products, annealing temperature, number of cycles

十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間數(shù)據(jù)用單因素方差(one way ANOVA)分析(LSD 法)，兩組間比較采用 Studentt檢驗(yàn)，P≤ 0.050 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及抗 vimentin 蛋白鑒定

正常和 AS 髖關(guān)節(jié)長梭形成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞胞質(zhì)抗 vimentin 抗體呈明顯紅色熒光，胞核亦有少量紅色熒光，呈陽性反應(yīng)，而細(xì)胞核 DNA 與 DAPI 結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。證實(shí)分離的細(xì)胞為滑膜成纖維細(xì)胞(bar＝60 μm)(圖 1)。此外，還可見相同單位面積下，AS 中抗 vimentin 抗體陽性細(xì)胞百分率與正常組的相近似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.27)。

二、rAAV 病毒載體轉(zhuǎn)染效率的測定

采用 TCID 50 測定病毒滴度，最終得到的 rAAV-lacZ 滴度為 1×1011病毒顆粒 / ml；使用 OD 260 法進(jìn)行病毒感染效力(MOI)測定，為 10±2。隨后，將 rAAV-lacZ 和 rAAV-CKLF1 分別轉(zhuǎn)染上述滑膜組織和第 3 代滑膜成纖維細(xì)胞后 3 天，X-gal 染色發(fā)現(xiàn) rAAV 載體能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞，效率高達(dá) 97.50% 以上，與無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0003)，且至少持續(xù) 21 天。rAAV-lacZ、rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后 21 天，收集標(biāo)本分別進(jìn)行 X-gal 染色，rAAV 病毒載體攜帶報(bào)告基因 lacZ 能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織，即 lacZ 組可見明顯的深藍(lán)色陽性染色，轉(zhuǎn)染效率分別為 98.0% 和 97.5%，明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組(15.0% 和 11.5%)、CKLF1 組(14.5% 和 17.0%)，分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 6.53 和 6.76 倍以及 8.48 和 5.74 倍(圖 2a，d)；同時(shí)，rAAV-lacZ 能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率分別為 97.5% 和 99.0%，明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組(15.0% 和 17.0%)、CKLF1 組(18.5% 和 21.0%)，分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 6.50 和 5.27 倍以及 5.82 和 4.71 倍(圖 2b，e)；Western blot 檢測發(fā)現(xiàn) rAAV-CKLF1 基因轉(zhuǎn)染能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，分別是無病毒轉(zhuǎn)染組的 4.56 和 3.82 倍(圖 2c，f)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0012 和P＝0.0001)。

圖1 正常和 AS 滑膜細(xì)胞抗 vimentin 蛋白免疫熒光檢測 (× 10)Fig.1 Anti-vimentin immunofluorescence assay of normal and AS synovial cells (× 10)

三、rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖的影響

rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染能有效促進(jìn)原位培養(yǎng)的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織中的細(xì)胞增殖(其中，AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染組的單位面積下細(xì)胞總數(shù)為 409.0 個(gè) / mm2，是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 2.00 和 2.09 倍，P＝0.0000)(圖 3a)，進(jìn)一步的 DNA 含量檢測得到了類似的結(jié)果(分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 1.44 和 1.55 倍以及 1.51 和 1.45 倍，P＝0.0260，P＝0.0020)(圖 3b，d)；同樣地，rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖(明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組和 lacZ 組，P＝0.0120，P＝0.0040)(圖 3c)。

圖2 X-gal 染色和 Western blot 檢測 rAAV 載體轉(zhuǎn)染效率 a：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 X-gal 染色；b：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 X-gal 染色；c、f：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 Western blot 檢測；d：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 X-gal 染色陽性率；e：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 X-gal 染色陽性率Fig.2 X-gal staining and Western blot detection of rAAV vector transfection efficiency a: X-gal staining of the normal and AS hip synovial tissue; b: X-gal staining of the normal and AS hip synovial fibroblasts; c, f: Western blot analysis of the normal and AS hip synovial fibroblasts; d: X-gal positive staining of the normal and AS hip synovial tissue; e: X-gal positive staining of the normal and AS hip synovial fibroblasts

四、rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染對致炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞進(jìn)行 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后 21 天，檢測培養(yǎng)體系上清液中 TNF-α 和 IL-6 表達(dá)水平，結(jié)果表明 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞的致炎性細(xì)胞因子分泌(明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組，P＝0.0060、P＝0.0020)(圖 4)。

五、CKLF1 基因過表達(dá)對 OCN 和 OPN 表達(dá)影響

正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 rAAV-hCKLF1 后 21 天，CKLF1 基因過表達(dá)能明顯促進(jìn) AS 成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨相關(guān)靶基因(OCN 和 OPN)(圖 5)。

六、CKLF1 基因過表達(dá)對成骨關(guān)鍵靶基因的表達(dá)影響

各組 OD 值均在 1.7～2.0；1.0% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，電泳圖條帶清晰，RNA 完整性好，無 DNA 和蛋白質(zhì)污染經(jīng)熔解曲線測定，得到單峰擴(kuò)增產(chǎn)物，無明顯非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，特異性好。rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染能促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá) CKLF1(分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 18.25、20.03 倍和 16.31、19.14 倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0056)；相似的結(jié)果也分別在 ALP、Runx2、OPN、OCN 和 Col1α2 的基因表達(dá)被發(fā)現(xiàn)(分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 3.16、3.56、3.02、3.29 倍；2.48、3.93、2.54、1.47 倍；1.74、1.94、2.82、2.65 倍；1.76、1.86、1.59、1.73 倍；1.81、2.07、2.77、2.97 倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P＝0.0410，#P＝0.0027)；值得注意的是，CKLF1 基因過表達(dá)對正常滑膜成纖維細(xì)胞上 CCR4 表達(dá)無明顯影響(P＝0.1209)，但能促進(jìn) AS 滑膜成纖維細(xì)胞 CCR4 的表達(dá)(P＝0.0381)(圖 6)。

圖3 CKLF1 基因有效促進(jìn)髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞的增殖 a：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織單位面積下細(xì)胞總數(shù)；b～c：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 DNA 含量檢測細(xì)胞增殖活性；d：WST-1 定量檢測成纖維細(xì)胞增殖情況Fig.3 CKLF1 gene promoted proliferation of hip synovial tissue and fibroblasts a: The total number of cells per unit area of the normal and ASA synovial tissue; b - c: DNA content detection of the normal and ASA synovial tissue; d: WST-1 quantitative detection of fibroblast proliferation ability

圖4 CKLF1 過表達(dá)促進(jìn)致炎性細(xì)胞因子分泌 a：rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染能促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌 IL-6，設(shè)定無病毒轉(zhuǎn)染組的 IL-6 表達(dá)量為 1.0，正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 rAAV-CKLF1 后，分別是其 2.62 和 3.30 倍 (P = 0.0020)；b：rAAVCKLF1 轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，TNF-α 分別升高 2.97 和 3.57 倍 (P = 0.0060)；c：正常髖關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后 21 天，IL-6 表達(dá)量明顯增加 (P = 0.0020)；d：滑膜組織的 TNF-α 表達(dá)水平分別升高 1.42 和 1.63 倍 (P = 0.0060)Fig.4 Overexpression of CKLF1 promoted secretion of inflammatory cytokines a: rAAV-CKLF1 transfection promoted the secretion of IL-6 by normal and AS hip synovial fibroblasts (the IL-6 expression level of the virus-free transfection group was 1.0, normal and AS hip synovial fibroblast transfection)After rAAV-CKLF1, they were 2.62 and 3.30 times, respectively (P = 0.0020); b: TNF-α increased by 2.97 and 3.57 times after transfection of rAAV-CKLF1 into fibroblasts respectively (P = 0.0060); c: IL-6 in normal hip synovial tissue expression increased after transfection with rAAV-CKLF1 for 21 days (2.05 and 2.45 times, respectively, in the virus-free transfection group, P = 0.0020); d: TNF-α expression levels of synovial tissue increased by 1.42 and 1.63 fold, respectively (P = 0.0060)

討 論

趨化因子家族是一類由免疫或非免疫細(xì)胞分泌的一級結(jié)構(gòu)相似的小分子蛋白，與七次跨膜的 G 蛋白偶聯(lián)受體特異結(jié)合，通過 G 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號至細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其生物學(xué)活性，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、過敏反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化等過程中發(fā)揮重要作用[2,7-8]。作為趨化因子家族新成員的 CKLF1 被證實(shí)主要有兩方面生物學(xué)功能：廣譜的趨化活性以及較強(qiáng)的促增殖與分化能力。在體外，Han 等[7]用真核表達(dá)載體 pcDI-CKLF1 轉(zhuǎn)染 COS-7 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) CKLF1 具有明顯趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性。同時(shí)將 pcDI-CKLF1 裸質(zhì)粒注射到 BALB / c 小鼠肌肉中，注射質(zhì)粒 10 天后，pcDICKLF1 組小鼠肌肉切片中炎性細(xì)胞浸潤明顯增多。Tan 等[19]將 pcDI-CKLF1 經(jīng)電脈沖肌肉注射導(dǎo)入至小鼠體內(nèi)，CKLF1 基因在肺內(nèi)獲得了高表達(dá)，可逆的引起細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)充血水腫，進(jìn)而導(dǎo)致因間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、膠原沉積引起的肺泡壁增厚，可致肺纖維化作用。在哮喘患者的肺組織和外周血白細(xì)胞中，內(nèi)源性 CKLF1 的表達(dá)明顯上調(diào)，提示 CKLF1 在呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)病過程中起到重要的作用。我們的前期研究結(jié)果提示 AS 患者髖關(guān)節(jié)囊滑膜組織 CKLF1 及其受體 CCR4 表達(dá)明顯升高，且與體內(nèi) C 反應(yīng)蛋白、血沉和 D-二聚體等的炎性狀態(tài)存在正相關(guān)[8]。而 Bal 等[20]通過檢測血清中可溶性白細(xì)胞介素-2 受體(sIL-2R)、IL-6 和 TNF-α 的水平后，認(rèn)為 IL-6 和 TNF-α 在 AS 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且其水平可作為疾病活動(dòng)度和診斷的評估工具。Gratacós 等[21]的研究發(fā)現(xiàn) AS 患者致炎性因子(IL-6 和 TNF-α)水平明顯升高，且 IL-6 與 AS 疾病活動(dòng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞過表達(dá) CKLF1 基因后，培養(yǎng)體系中的致炎性細(xì)胞因子 IL-6 和 TNF-α 呈高水平表達(dá)，且上述促炎性作用至少持續(xù) 21 天。IL-6 和 TNF-α 的持續(xù)高表達(dá)將會趨化更多的致炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)向炎癥部位遷移，進(jìn)而引起致炎性因子“瀑布樣”增加，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[19-21]。

圖5 CKLF1 促進(jìn)骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 OCN 和 OPN 表達(dá) (bar = 60 μm) a：OCN 染色檢測成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞；b：OPN 染色檢測成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞Fig.5 CKLF1 gene transfer promoted expression of extracellular matrix proteins OCN and OPN (bar = 60 μm) a: OCN staining of the osteoblast and osteogenic precursor cell; b: OPN staining of the osteoblast and osteogenic precursor cell

圖6 CKLF1 對其自身信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及成骨分化相關(guān)靶基因表達(dá)的 影響Fig.6 Effects of CKLF1 on its own signal transduction and expression of target genes related to osteogenic differentiation

Ke 等[22]利用 CKLF1 真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人和小鼠骨髓干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CKLF1 能促進(jìn)人和小鼠骨髓造血干 / 祖細(xì)胞的增殖和分化，且與 GM-CSF 有協(xié)同刺激作用。Han 等[7]發(fā)現(xiàn)，CKLF1 在小鼠骨骼肌中的過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖分化加速，增加生肌素的表達(dá)水平及一些生長因子的活性，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的增殖。最近，有學(xué)者通過觀察 CKLF1 對體外培養(yǎng)的人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖作用，首次確定 CKLF1 對體外培養(yǎng)的人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞具有促增殖作用，提示 CKLF1 可能參與動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)膜增厚的過程[23]。本研究通過對 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織切片后，進(jìn)行 HE 染色并計(jì)數(shù)單位面積下細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CKLF1 基因過表達(dá)能促進(jìn)原位培養(yǎng)的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織中的細(xì)胞增殖，此外，還發(fā)現(xiàn) CKLF1 基因轉(zhuǎn)染能有效促進(jìn)體外單層培養(yǎng)的正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞增殖。本研究對 CKLF1 基因過表達(dá)的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織和成纖維細(xì)胞進(jìn)行 DNA 含量檢測，也發(fā)現(xiàn) CKLF1 能促進(jìn)兩種體系中的細(xì)胞 DNA 含量增加。表明 CKLF1 基因能通過增強(qiáng) AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的 DNA 轉(zhuǎn)錄合成和增加細(xì)胞數(shù)目而促進(jìn)其增殖。

Dalby 等[24]認(rèn)為 OCN 和 OPN 可作為檢測成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。筆者對正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 CKLF1 基因過表達(dá)對其成骨關(guān)鍵靶基因表達(dá)可能的影響研究中，發(fā)現(xiàn) rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染能促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá) ALP、Runx2、OPN、OCN 和 Col1α2。而在 CKLF1 轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞后的 OPN 和 OCN 免疫熒光檢測中也有相類似的發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，CKLF1 基因過表達(dá)對正?；こ衫w維細(xì)胞上 CCR4 表達(dá)無明顯影響，但能促進(jìn) AS 滑膜成纖維細(xì)胞 CCR4 的表達(dá)，這也可能部分解釋 CKLF1 在促進(jìn)正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞增殖方面的作用相似，但能促進(jìn) AS 滑膜成纖維細(xì)胞分泌更多的致炎性細(xì)胞因子表達(dá)。以上結(jié)果還表明，CKLF1 基因一方面可能通過增強(qiáng)成纖維細(xì)胞中的成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化；還可能通過增加成骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝與沉積，進(jìn)而誘導(dǎo)鈣、磷聚集和基質(zhì)礦物質(zhì)化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向成骨轉(zhuǎn)化，進(jìn)而成為成骨細(xì)胞和發(fā)揮成骨功能。上述研究發(fā)現(xiàn)也與筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[10]，即 CKLF1 能促進(jìn) AS 髖關(guān)節(jié)囊兩種組織細(xì)胞(韌帶和滑膜)的成骨轉(zhuǎn)化，因而有理由推測 CKLF1 可能在 AS 關(guān)節(jié)病理性骨化過程中發(fā)揮重要作用。

綜合以上研究結(jié)果表明，CKLF1 能促進(jìn) AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞增殖和致炎性細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)其成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，推測 CKLF1 在 AS 關(guān)節(jié)周圍成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化至病理性骨化過程中可能發(fā)揮重要作用。因而，繼續(xù)深入研究 CKLF1 和成骨相關(guān)信號通路之間的相互作用關(guān)系及其在關(guān)節(jié)病理性骨化動(dòng)物模型中的作用及機(jī)制，為靶向 CKLF1 信號防治 AS 關(guān)節(jié)病理性骨化與強(qiáng)直提供新的理論基礎(chǔ)。