胡夢婷，馬薇薇，徐文丹，吳畏，嚴(yán)正杰，劉嘉茵，劉金勇,崔毓桂

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210029)

氧化應(yīng)激是細(xì)胞衰老的共同機(jī)制之一。高齡女性卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、胚胎發(fā)育潛能差，其主要原因就是卵母細(xì)胞老化，即卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高、線粒體功能障礙。α硫辛酸、輔酶Q10、白藜蘆醇和半胱氨酸等抗氧化劑能夠降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平、改善線粒體功能，具有一定的延緩細(xì)胞老化的作用，但在卵母細(xì)胞的作用有待進(jìn)一步研究[1-2]。因此，研究卵母細(xì)胞老化的機(jī)制和尋求新型抗氧化劑，對于改善高齡女性卵母細(xì)胞質(zhì)量、提高妊娠率、改進(jìn)輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局具有潛在的意義。腐胺是細(xì)胞內(nèi)由L-精氨酸合成的聚陽離子小分子化合物，鳥氨酸脫羧酶(ODC1)催化L-鳥氨酸脫羧生成腐胺，ODC1是多胺生物合成的限速酶，也是在多胺合成中真核生物酶。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)腐胺參與控制細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的自由基、抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[3]，在細(xì)胞生長、增殖、分化、發(fā)育、免疫、遷移、基因調(diào)控、DNA穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)和核酸合成中發(fā)揮著重要作用[4]。腐胺在卵母細(xì)胞的作用如何？在本文研究腐胺是否通過抗氧化應(yīng)激的機(jī)制提高體外培養(yǎng)的高齡卵母細(xì)胞的質(zhì)量，以探討其遠(yuǎn)期臨床應(yīng)用的價(jià)值。

材料與方法

一、材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7月齡C56/B6J雌鼠購于北京維通利華生物公司，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心至9月齡(相當(dāng)于人類女性38～40歲年齡)。光照周期12 h/12 h；自由進(jìn)食和飲水。本研究得到南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

2. 實(shí)驗(yàn)試劑：鳥氨酸脫羧酶(ODC1)催化L-鳥氨酸脫羧生成腐胺，且 ODC1是多胺生物合成的限速酶[5]。α-二氟甲基鳥氨酸(α-difluoromethylornithine，DFMO，sigma公司，美國)是ODC1的特異性、高效抑制劑，可明顯抑制細(xì)胞內(nèi)多胺合成、顯著降低多胺水平，已見于多項(xiàng)研究報(bào)道[3，5-6]。孕馬血清促性腺激素(PMSG)(寧波舒生第二激素廠)。M2操作液、人表皮因子(hEGF)、重組人卵泡刺激素(rhFSH)[7-8]、透明質(zhì)酸酶、腐胺、臺(tái)式酸、礦物油、γ-actin抗體(sigma，美國)；兔抗大鼠SOD2多克隆抗體，兔抗大鼠SOD1多克隆抗體(proteintech，美國)；JC-1熒光探針(Molecular Probes，Eugene，Oregon，美國)；PVDF膜(GE Heahhcare，美國)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(ECL detection kit，Millipore，美國)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)：9月齡C56/B6J雌鼠腹腔注射PMSG 10 U，48 h后斷頸處死。立即取出卵巢，在顯微鏡下用1 ml無菌注射器戳破卵泡，用負(fù)壓管虹吸卵丘細(xì)胞包裹完整的GV-COCs，平均置入IVM、0.5 mmol/L DFMO、0.5 mmol/L腐胺組中。采用微滴式培養(yǎng)，10枚GV-COCs置于一滴，每滴20 μl，覆蓋2 ml礦物油以避免蒸發(fā)。在37℃、5%CO2、21%O2條件下培養(yǎng)16～18 h。

2. 卵母細(xì)胞收集：將培養(yǎng)后的COCs置于透明質(zhì)酸酶中吹打，使包裹的卵丘細(xì)胞脫落。轉(zhuǎn)移卵母細(xì)胞，置于M2微滴中，觀察裸卵并計(jì)數(shù)完成第一次減數(shù)分裂及排出第一極體的卵母細(xì)胞(即MⅡ期卵母細(xì)胞)。

3. 單卵母細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)：卵母細(xì)胞的選取及裂解：MⅡ期卵母細(xì)胞以臺(tái)式酸酸化、吹吸，去除透明帶，PBS液洗滌卵母細(xì)胞3次。制備終濃度為30 mmol/L Tris-HCL、5 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCL、體積分?jǐn)?shù) 1.5% Tween-20及2 mg/ml 蛋白酶K的細(xì)胞裂解液，將卵母細(xì)胞移入裝有10 μl 細(xì)胞裂解液的 0.2 ml PCR 管中；55℃加熱2 h，95℃10 min，滅活蛋白酶K，裂解卵細(xì)胞。然后置于-80℃用于后續(xù)PCR擴(kuò)增模板。

PCR模板制備及引物設(shè)計(jì)：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，合成引物(由南京銳真生物技術(shù)有限公司合成)ND2 Forward 5’-CAC GAT CAA CTG AAG CAG CAA-3’，Reverse 5’-ACG ATG GCC AGG AGG ATA ATT-3’。

標(biāo)準(zhǔn)品制備：1 μl模板，10 μl SYBR Green PCR Master Mix，0.4 μl ROX Reference Dye，引物各0.8 μl，余下體積用雙蒸水補(bǔ)齊至20 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min：95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；DNA提純：擴(kuò)增產(chǎn)物加入500 μl無水乙醇，4℃，12 000 rpm離心10 min，棄上清；加入500 μl 75%乙醇12 000 rpm離心10 min，棄上清，將提純擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物分量，計(jì)算出分離純化的DNA樣品即標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)；將標(biāo)準(zhǔn)品按照 1∶10的比例進(jìn)行等倍比稀釋而形成梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品等比自稀釋：10-3～10-8。

mtDNA 拷貝數(shù)檢測：使用Quanti Nova SYBR Green PCR 試劑盒，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀上檢測mtDNA 拷貝數(shù)。根據(jù)試劑盒說明書制備20 μl PCR反應(yīng)體系：1 μl模板，10 μl SYBR Green PCR Master Mix，0.4 μl ROX Reference Dye，上下游引物各0.8 μl，余下體積用雙蒸水補(bǔ)齊至20 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min：95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；設(shè)定溶解曲線，檢測 PCR 反應(yīng)特異性。每次反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品確定，每個(gè)樣品的起始mt DNA拷貝數(shù)通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

4. 氧化應(yīng)激水平檢測：檢測高齡卵母細(xì)胞的ROS水平。使用50-羧基-20，7-二氟二氫熒光素二乙酸酯(carboxy-DFFDA；Molecular Probes)，一種能夠檢測強(qiáng)氧化劑如H2O2和過氧亞硝酸鹽的熒光探針。將去除卵丘細(xì)胞的MⅡ期卵母細(xì)胞置入預(yù)熱10 min的熒光探針微滴中，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后在預(yù)熱的M2操作液中洗滌3次，將其放置于預(yù)熱的玻璃底培養(yǎng)皿中進(jìn)行掃描拍攝。

5. 線粒體膜電位檢測：膜電位敏感染料JC-1用于評估線粒體的功能活性。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。用DMSO制備2 mM JC-1儲(chǔ)備溶液，保存于-20℃。使用前，將儲(chǔ)備溶液用M2稀釋至工作濃度2 μM。將工作液于培養(yǎng)皿中制成微滴，用礦物油覆蓋防止工作濃度改變，置于培養(yǎng)箱中預(yù)熱10 min。將卵母細(xì)胞置于微滴中放入培養(yǎng)箱孵育30 min，然后在M2操作液中洗滌3次，置入預(yù)熱的玻璃底培養(yǎng)皿微滴中，后進(jìn)行共聚焦觀察。在相同的暴露強(qiáng)度下捕獲所有卵母細(xì)胞。通過測量每個(gè)通道中整個(gè)卵母細(xì)胞的總熒光來進(jìn)行熒光分析。使用校正的總細(xì)胞熒光(CTCF)方法將每個(gè)通道的平均灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為測量區(qū)域。線粒體膜電位為總紅色CTCF除以總綠色CTCF。

6. Western Bolting：收集30枚MⅡ期卵母細(xì)胞置于5 μl 蛋白裂解液中，與4～10% SDS-PAGE梯度膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用TBS(含5%脫脂奶)37℃處理l h后，加入SOD2抗體(1∶500稀釋)或SOD1抗體(1∶500稀釋)孵育，內(nèi)參是兔抗鼠γ-actin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜。TBST(TBS+0.1%Tween 20)洗脫后，二抗(驢抗兔IgG，1∶1 000稀釋)37℃孵育1 h，TBST洗脫。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(ECL)測定熒光強(qiáng)度。條帶灰度值用天能凝膠成像系統(tǒng)軟件(Tanon Gis Image system ID Danalysis，上海)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腐胺增加高齡卵母細(xì)胞的成熟率

三組高齡卵母細(xì)胞成熟率比較(圖1)。腐胺組卵母細(xì)胞成熟率(87.57±1.70)%，顯著高于對照組(66.02±4.05)%，平均升高了22%(P<0.01)；DFMO組卵母細(xì)胞成熟率為(66.96±3.40)%，與對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、腐胺減少高齡卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧

腐胺減少高齡卵母細(xì)胞內(nèi)的活性氧(圖2)。腐胺組卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著減少，DFMO組卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著升高(圖2A)。與對照組(18 714 873±1 641 482)相比，腐胺組活性氧水平(11 827 188±1 290 525)下降了37%(P<0.01)；DFMO組(52 119 088±4 178 825)活性氧水平升高179%(P<0.01)(圖2B)。

**P<0.01圖1 腐胺提升高齡卵母細(xì)胞的成熟率

A、B、C：熒光顯示卵母細(xì)胞內(nèi)ROS,carboxy-DFFDA 綠色染料標(biāo)記氧自由基,標(biāo)尺50 μm;D：卵母細(xì)胞ROS水平統(tǒng)計(jì)分析,**P<0.01圖2 腐胺減少高齡卵母細(xì)胞內(nèi)ROS

三、腐胺提升高齡卵細(xì)胞內(nèi)SOD1表達(dá)

腐胺提升高齡卵母細(xì)胞內(nèi)SOD1蛋白的表達(dá)(圖3A)。腐胺組卵母細(xì)胞內(nèi)SOD1蛋白表達(dá)較對照組顯著升高(P<0.05)；DFMO組SOD1蛋白表達(dá)較對照組顯著下降(P<0.05)(圖3B)。

*P<0.05圖3 腐胺提升高齡卵母細(xì)胞內(nèi)SOD1蛋白表達(dá)

四、腐胺對高齡卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

腐胺對高齡卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響(圖4)。以DFMO抑制卵母細(xì)胞內(nèi)腐胺生成，高齡卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)(48 811±1 624)較對照組(35 026±6 402)增加24.4%(P<0.05)。但是，外源性添加腐胺，高齡卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)(42 137±5 772)未發(fā)生顯著改變(P>0.05)。

與對照組比較，*P<0.05圖4 抑制腐胺增加高齡卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)

五、腐胺提升高齡卵母細(xì)胞線粒體膜電位

線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子泵將線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵出膜間腔，使內(nèi)膜外電位為正、膜內(nèi)為負(fù)，這種膜內(nèi)外的電位差稱為線粒體跨膜電位(△Ψm)，其閾值變化與氧化代謝水平相關(guān)，常被用來評估線粒體功能。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光[9-10](圖5A)。與對照組相比(0.62±0.05)，腐胺組線粒體膜電位(2.20±0.18)升高253%(P<0.01)，DFMO組(0.33±0.05)下降46.7%(P<0.01)(圖5B)。

討 論

卵巢卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞內(nèi)，腐胺可能參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟及排卵[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在LH作用下卵巢組織ODC1升高，細(xì)胞內(nèi)腐胺水平顯著升高，激發(fā)卵母細(xì)胞成熟和隨后的卵泡破裂以釋放成熟卵；LH誘導(dǎo)卵巢ODC1活性比FSH的作用更有效，故認(rèn)為腐胺對圍排卵期的卵泡成熟是必要的[11-12]。有研究提示，高齡雌性小鼠卵巢內(nèi)ODC1以及腐胺的濃度降低[11-14]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在IVM培養(yǎng)液中添加腐胺有效提高高齡小鼠卵母細(xì)胞成熟率；添加DFMO以抑制ODC1，抑制內(nèi)源性腐胺的生成，卵母細(xì)胞成熟率較腐胺組明顯降低。與對照組比較，培養(yǎng)液中添加DFMO后高齡小鼠卵母細(xì)胞成熟率沒有顯著下降，表明高齡小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ODC1活性低、腐胺濃度低，DFMO作用不明顯。

線粒體是卵母細(xì)胞質(zhì)中含量最為豐富的細(xì)胞器，其數(shù)量、結(jié)構(gòu)和活性在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中發(fā)生顯著變化，線粒體拷貝數(shù)由原始生殖細(xì)胞中不足10個(gè)逐漸增加到成熟卵母細(xì)胞的105個(gè)以上。線粒體產(chǎn)生的 ATP 是卵母細(xì)胞、受精卵以及早期胚胎發(fā)育的主要能量來源[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中添加腐胺后高齡小鼠卵母細(xì)胞的線粒體拷貝數(shù)沒有顯著改變(P>0.05)；添加DFMO后，線粒體拷貝數(shù)增加，這可能是因?yàn)槁涯讣?xì)胞通過代償性增加線粒體數(shù)量來平衡細(xì)胞內(nèi)缺乏腐胺導(dǎo)致的線粒體功能不足。近年研究顯示，線粒體膜電位的降低是細(xì)胞凋亡的早期事件。卵母細(xì)胞線粒體膜電位與其胚胎發(fā)育潛能相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，高齡小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液中添加腐胺，線粒體膜電位增加，提高其線粒體功能；DFMO的作用與之相反。說明腐胺提高卵母細(xì)胞線粒體膜電位、有效地改善線粒體功能。

A：高齡卵母細(xì)胞線粒體膜電位的觀察,用JC-1染料檢測線粒體膜電位，紅色表示高線粒體膜電位,綠色表示低線粒體膜電位,標(biāo)尺50 μm;B：卵母細(xì)胞線粒體膜電位統(tǒng)計(jì)分析;**P<0.01圖5 腐胺提升高齡卵母細(xì)胞線粒體膜電位

出生前卵母細(xì)胞阻滯在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，這一階段稱為生發(fā)泡(GV)。人GV期卵母細(xì)胞可在卵泡內(nèi)停留40余年[19-20]。未成熟卵母細(xì)胞通過氧化磷酸化維持低水平的ATP，滿足卵母細(xì)胞對能量的需求；而隨著卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，對能量需求大大增加。卵母細(xì)胞在氧化磷酸化產(chǎn)生ATP過程中，也產(chǎn)生副產(chǎn)物ROS。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS和抗氧化之間維持動(dòng)態(tài)平衡，使細(xì)胞內(nèi)ROS保持一定的低水平。當(dāng)線粒體功能不足，這種平衡被破壞，ROS升高，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育成熟、受精、胚胎發(fā)育[21-22]。有研究顯示，高齡卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，胚胎發(fā)育潛能降低[21，23]。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)高齡卵母細(xì)胞時(shí)添加腐胺，顯著減少細(xì)胞內(nèi)ROS；而DFMO使ROS水平明顯增加。在細(xì)菌以及細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，腐胺作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑可以保護(hù)高氧化應(yīng)激環(huán)境中的細(xì)菌和細(xì)胞[24]。卵母細(xì)胞的成熟依賴于活性氧與抗氧化之間的氧化還原平衡。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)3種亞型的超氧化物歧化酶(SOD1-3)。本文實(shí)驗(yàn)中，腐胺并不影響卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。有文獻(xiàn)報(bào)道，老齡小鼠卵巢內(nèi)SOD1水平降低[27]；本研究發(fā)現(xiàn)，腐胺有效地提高卵母細(xì)胞內(nèi)SOD1表達(dá)，DFMO抑制腐胺生成時(shí)明顯減少SOD1表達(dá)，表明腐胺也能夠有效地提高卵母細(xì)胞內(nèi)SOD1表達(dá)，發(fā)揮抗氧化的作用，有助于達(dá)成卵母細(xì)胞內(nèi)氧化-還原反應(yīng)的平衡。

綜上所述，腐胺通過改善線粒體功能、以及多重抗氧化的機(jī)制，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，提高高齡卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。我國目前放開了二胎政策，越來越多高齡女性有生育需求，但是高齡女性的生育結(jié)局較低[18，28]。與年齡相關(guān)的女性生育能力下降主要?dú)w因于卵巢衰老引起的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[29]。本研究表明，腐胺改善高齡卵母細(xì)胞的質(zhì)量，對改善高齡婦女的生育結(jié)局具有潛在的臨床意義。