明 艷 張祖艷 胡 莉 夏小文 柯曉瓊

湖北省陽(yáng)新縣婦幼保健院婦產(chǎn)科，湖北陽(yáng)新 435200

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常，但不排除糖類不耐受在妊娠前已存在的疾病，是妊娠期常見(jiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重危害母嬰健康。近年來(lái)，關(guān)于GDM的發(fā)病機(jī)制研究雖已取得較大進(jìn)展，但仍未完全明確，其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是GDM的重要病理機(jī)制[1-2]。此外，諸多觀點(diǎn)認(rèn)為炎癥和免疫異常是胰島素抵抗的重要病因，GDM患者血清及胎盤(pán)組織白細(xì)胞介素1/6（IL-1/6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及人白細(xì)胞抗原DRB1基因（HLA-DRB1）表達(dá)異常[3-6]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度19～24 nt的非編碼單鏈RNA分子，廣泛參與多種良、惡性疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來(lái)，相關(guān)研究證實(shí)多種miRNA參與2型糖尿病和GDM的發(fā)生和進(jìn)展[7-8]。同時(shí)，有研究表明，miRNA-132及miRNA-301a作為促炎性調(diào)節(jié)因子廣泛參與炎癥、免疫等多種病理生理學(xué)進(jìn)程[9-11]，但尚未見(jiàn)其與GDM相關(guān)研究。因此，本研究通過(guò)分析GDM和正常孕婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a的表達(dá)差異，分析其與IR的可能關(guān)系，探討miRNA-132及miRNA-301a參與GDM病生理過(guò)程及其作為GDM預(yù)測(cè)和治療靶標(biāo)的可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于2017年3月～2018年2月在我院產(chǎn)檢并分娩的GDM孕婦30例，作為觀察組（GDM組），隨機(jī)選取同期于我院產(chǎn)檢并分娩且無(wú)妊娠合并癥的正常孕婦30例為對(duì)照組。GDM組納入標(biāo)準(zhǔn)為符合2013年世界衛(wèi)生組織GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并免疫系統(tǒng)性疾病、傳染性疾病、慢性肝腎功能損傷性疾病、心臟病、孕前有糖尿病史或有糖尿病家族史、既往有高血壓或高血脂等代謝性疾病。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查 受試者于孕24～28周時(shí)清晨且空腹8h后抽取肘靜脈血，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀（Cobase41）檢測(cè)血糖相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括：空腹血糖（FPG）及空腹胰島素（FINS），檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清炎癥因子水平，包括：IL-1，IL-6，IL-10，TNF-α及CRP水平，試劑盒購(gòu)自杭州碧云天公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)RD公司（Phomo型）。胰島功能采用HOMA模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment insulin resistant，HOMA-IR）進(jìn)行評(píng)價(jià)，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，剩余血清凍存于-80℃用于miRNA-132及miRNA-301a檢測(cè)。

1.2.2 血清游離RNA提取 采用Trizol 試劑盒（日本Takara公司）提取總RNA，所有步驟均按試劑盒說(shuō)明操作：加入Trizol充分混勻后靜置，采用苯酚/氯仿去蛋白處理，乙醇沉淀并清洗RNA后加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行純度檢測(cè)。

1.2.3 血清游離miRNA檢測(cè) 取2μg總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒（日本Takara公司）進(jìn)行q-PCR，每個(gè)檢測(cè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以U6位內(nèi)參照。PCR引物均由上海生工生物公司合成，miRNA-132：5'-CCAGCATAACAGTCTACAGCCA-3'，5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3'；miRNA-301a：5′-ACACTCCAGCTGGGCAGTGCAATAGTA TTGTC-3′，5′ -CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′ ；U6：5 ′ -GCT-TCG-GCA-GCA-CAT-ATA-CTAAAA-T--3′，5′ -CGC-TTC-ACG-AAT-TTGCGT-GTC-AT-3′。miRNA表達(dá)量以2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiRNA-CtU6。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比分析兩組研究對(duì)象年齡，BMI，胰島素抵抗相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)FPG和FINS，血清炎癥相關(guān)因子以及血清游離miRNA-132及miRNA-301a水平，并采用HOMA-IR計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。其中FPG和FINS是評(píng)判GDM的直接指標(biāo)，將FPG和FINS數(shù)值采用HOMA模型計(jì)算可以得到間接反映胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR，其值越大說(shuō)明胰島素抵抗越嚴(yán)重。血清炎癥因子包括促炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、CRP以及抗炎因子IL-10。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。采用單直線相關(guān)性分析方法分析與血清miRNA-301a及miRNA-132水平相關(guān)的因素，r值為正數(shù)表示成正相關(guān)關(guān)系，r值為負(fù)數(shù)表示成負(fù)相關(guān)關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

兩組研究對(duì)象之間年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GDM組孕婦BMI及HOMA-IR指數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；此外，GDM 組孕婦血清中 FPG、FINS、IL-1、IL-6、TNF-α及CRP水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而血清IL-10水平低于對(duì)照組孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表l。

表1 兩組對(duì)象一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較（±s）

表1 兩組對(duì)象一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較（±s）

注：BMI：體質(zhì)指數(shù)；FPG：空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HOMA-IR：胰島素抵抗指數(shù)；IL-1：白介素1；IL-6：白介素6；IL-10：白介素10；TNF-α：腫瘤壞死因子α；CRP：C型反應(yīng)蛋白

組別 年齡（歲）CRP（g/L）GDM組（n=30） 26.34±7.52 24.98±4.35 6.86±0.93 13.98±1.89 4.26±1.92 190.03±10.33 108.36±7.84 21.86±2.74 12.03±2.58 6.89±1.58正常組（n=30） 26.05±5.93 22.31±3.43 4.35±0.67 9.69±1.63 1.87±1.32 99.67±6.47 62.75±7.03 36.01±3.13 6.19±1.64 3.89±0.87 t 0.166 2.640 11.990 9.415 5.618 40.600 23.720 18.630 10.460 9.110 P 0.869 0.011 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 BMI（kg/m2）FBG（mmol/L） （mIU/L） HOMA-IR L-1（ng/L）FINS IL-6（ng/L）IL-10（ng/L）TNF-α（μg/L）

2.2 兩組產(chǎn)婦血清游離miRNA-132及-301a表達(dá)水平比較

GDM組孕婦的血清游離miRNA-301a表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而miRNA-132水平雖稍高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組產(chǎn)婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a表達(dá)水平（±s）

表2 兩組產(chǎn)婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a表達(dá)水平（±s）

組別 n miRNA-132 miRNA-301a GDM組 30 0.474±0.038 0.266±0.067正常組 30 0.215±0.041 0.239±0.073 t 25.380 1.492 P 0.000 0.141

2.3 miRNA-132及miRNA-301a表達(dá)相關(guān)因素分析

采用單直線相關(guān)分析方法分析各觀察項(xiàng)目與血清游離miRNA-132及-301a表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果表明，血清miRNA-301a水平與年齡、BMI無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與血清FBG、FINS、IL-1、IL-6、TNF-α 及 CRP水平和 HOMA-IR 指數(shù) 呈 正 相 關(guān)（r=0.2614、0.3538、0.5025、0.3017、0.1947、0.1435、0.5439，均 P ＜ 0.05），與血清 IL-10水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.1856，P＜0.05）；而血清游離miRNA-132水平與觀察項(xiàng)目均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞ 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各項(xiàng)目與血清游離miRNA-132及miRNA-301a水平的相關(guān)性分析

3 討論

炎癥與妊娠期糖尿病（GDM）的發(fā)展密切相關(guān)，炎癥失調(diào)的證據(jù)（即促炎和抗炎介質(zhì)失衡）最早可以在妊娠早期被發(fā)現(xiàn)，而后進(jìn)展為GDM。GDM患者體內(nèi)促炎和抗炎介質(zhì)失衡多由自身免疫失調(diào)所引起，也是GDM胰島素抵抗的重要病理機(jī)制之一[3]。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的推廣，近年來(lái)miRNA在GDM發(fā)病中的作用和機(jī)制研究逐漸成為GDM研究的熱點(diǎn)之一。本研究通過(guò)分析GDM和正常孕婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a的表達(dá)差異，分析其與IR和炎癥因子失衡的可能關(guān)系，探討miRNA-132及miRNA-301a水平與GDM之間的可能關(guān)系。

在正常妊娠期間，T輔助細(xì)胞的平衡從促炎性Th1（其中細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子IL-1、IL-2、IL-6、干擾素γ、TNF和CRP等）轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔訲h2（其中抗炎因子IL-10、IL-4、IL-5和IL-13等占主導(dǎo)地位），它們?cè)谀阁w各器官機(jī)能穩(wěn)定及母胎關(guān)系中具有保護(hù)作用[3，12]。當(dāng)體內(nèi)自身免疫紊亂時(shí)，通過(guò)導(dǎo)致保護(hù)性抗炎因子水平低于促炎因子水平從而導(dǎo)致促炎和抗炎介質(zhì)失衡，從而引發(fā)胰島β細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致胰島素抵抗。而本研究中也證實(shí)GDM組孕婦血清促炎因子水平明顯高于正常組，而抗炎因子則明顯低于正常對(duì)照組，這也與其他相關(guān)研究結(jié)果一致。

近年來(lái)，有學(xué)者證實(shí)miRNA-132及-301a的表達(dá)升高與機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)存在聯(lián)系[9-10]，miRNA-132及miRNA-301a升高可引起促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及COX2等水平升高，引起機(jī)體抗炎-促炎介質(zhì)失衡，導(dǎo)致相關(guān)器官結(jié)構(gòu)和功能損害，而其作用可能通過(guò)NF-κB或STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[9，13]，且這些通路都與GDM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-17]。而抑制miRNA-132及miRNA-301a的表達(dá)可明顯緩解機(jī)體炎癥紊亂狀態(tài)[9，12]。 此 外，miRNA-132 及 miRNA-301a還 與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[18-19]。而在本研究中，GDM組孕婦miRNA-301a水平明顯增高，同時(shí)伴有促炎因子水平升高及抗炎因子水平降低，且血清游離miRNA-301a水平與促炎因子水平及胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，而與抗炎因子水平呈負(fù)相關(guān)，因此我們推測(cè)，miRNA301a水平增加引起促炎癥因子水平上升，使T輔助細(xì)胞的平衡從促炎性Th1向抗炎性Th2轉(zhuǎn)換受阻，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能損害而發(fā)生胰島素抵抗。此外，miRNA-132主要通過(guò)抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulation 2 homolog 1，SIRT1）發(fā)揮促炎作用[20]，而GDM患者血清SIRT1水平較正常者升高，且SIRT1對(duì)GDM的發(fā)生發(fā)展具有雙重調(diào)節(jié)作用[21-24]，這可能是GDM患者血清miRNA132水平與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的可能原因，仍有待相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，GDM患者機(jī)體抗炎-促炎介質(zhì)失衡，血清游離miRNA-301a水平與GDM發(fā)病密切相關(guān)，其可能通過(guò)引起機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)紊亂從而導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生，可作為GDM重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，而血清miRNA132水平與GDM無(wú)明顯相關(guān)性。本研究不足之處在于樣本量較小，且只檢測(cè)了血清游離miRNA水平，因此，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)論及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的大樣本及深層次的研究予以證實(shí)。