樊紅麗，高 麗，毛小琴，張 米，李正倫，楊翠先

(1. 云南省傳染病?？漆t(yī)院/艾滋病關愛中心檢驗科，云南 昆明 650301； 2. 昆明理工大學醫(yī)學院,云南 昆明 650500； 3. 云南省第一人民醫(yī)院檢驗科,云南 昆明 650032)

截至2017年底，云南省累計報告存活人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者和艾滋病患者98 878例，居全國前五。隱球菌性腦膜炎常感染免疫力低下人群，尤其是艾滋病患者，其抗真菌治療效果差，是艾滋病患者死亡的主要原因之一[1]。在較長的抗真菌治療過程中(平均周期為12個月)，隱球菌對抗真菌藥物會產生耐藥，從而導致治療失敗[2]。因此，臨床治療需要實驗室的體外藥物敏感性報告作為依據(jù)。不同地區(qū)藥敏折點是有差異的[3]，目前，云南地區(qū)新生隱球菌常用藥物藥敏折點情況未見報道。對本院2007年8月—2018年7月艾滋病患者標本中分離的新生隱球菌菌株進行藥物敏感性檢測，并分析其報告，以期為本地區(qū)新生隱球菌的藥物敏感性折點建立提供數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 304 株新生隱球菌全部分離自云南省傳染病醫(yī)院住院艾滋病患者標本，患者來自云南省的16個地州市。同一患者相同標本分離的新生隱球菌均進行藥敏檢測，經比較檢測結果相同，僅納入一次檢測結果進行統(tǒng)計分析，同一患者不同標本分離的新生隱球菌均納入研究。質控菌株為克柔假絲酵母菌ATCC 6258 和近平滑假絲酵母菌ATCC 22019。

1.2 菌株培養(yǎng)及復核鑒定 將-80℃保存的臨床分離的新生隱球菌菌株置于20℃復蘇24 h，使其恢復繁殖活力。在無菌條件下，將其轉種至沙保羅(SGC)培養(yǎng)基上，25℃孵育培養(yǎng)48～72 h，形成肉眼可見的菌落，然后進行菌種復核鑒定。復核鑒定由本院微生物室工作人員參照全國臨床檢驗操作規(guī)程第四版要求[4]，即根據(jù)菌落生長特征、鏡下形態(tài)以及生化反應，結合VITEK 2 YST 卡進行菌種鑒定。

1.3 藥敏試驗 采用Thermo Fisher公司的真菌藥敏板進行藥敏試驗，即比色微量稀釋法，每塊藥敏板都包被有適當稀釋濃度的抗真菌藥物和顯色劑。在藥敏板中，各抗真菌藥物及濃度范圍分別為5-氟胞嘧啶0．06～64 μg/mL，泊沙康唑0．008～8 μg/mL，伏立康唑0．008～8 μg/mL，伊曲康唑0．015～16 μg/mL，氟康唑0．012～256 μg/mL，兩性霉素B0．12～8 μg/mL。實驗嚴格按照試劑盒說明書加樣后，在非CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h 讀取結果。根據(jù)顏色改變目視觀察抑制微生物生長的抗真菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。實驗同時檢測克柔假絲酵母菌ATCC 6258和近平滑假絲酵母菌ATCC 22019進行質量控制。

1.4 結果判讀 藥物敏感性判斷參照全國臨床檢驗操作規(guī)程第四版[4]推薦的假絲酵母菌藥物敏感性判斷標準。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19．0 統(tǒng)計軟件對6種抗真菌藥物的MIC50、MIC90和MIC 幾何均數(shù)進行分析。

2 結果

2.1 標本來源 共收集2007年8月—2018年7月云南省傳染病醫(yī)院住院艾滋病患者標本分離的新生隱球菌304株，標本來源見表1。骨髓中檢出隱球菌的11例患者中，在治療的不同時期，有5 例曾在患者血液中檢出，2 例曾在患者腦脊液中檢出，4例僅在骨髓中檢出。

表1304株新生隱球菌標本來源分布

Table1Distribution of specimen sources of 304 strains ofC.neoformans

標本類型分離株數(shù)構成比(%)腦脊液19263.16血9631.58骨髓113.62胸腔積液30.98痰10.33組織10.33

2.2 抗真菌藥物的敏感性

2.2.1 6 種常用抗真菌藥物對新生隱球菌的MIC 值 藥敏試驗結果顯示，304株新生隱球菌對唑類抗真菌藥物(除氟康唑外)MIC均<1 μg/mL，多烯類的兩性霉素B MIC≤4 μg/mL，氟康唑及5-氟胞嘧啶的MIC≤32 μg/mL。見表2。

2.2.2 5 種抗真菌藥物對新生隱球菌的敏感性分析 未發(fā)現(xiàn)對伊曲康唑和氟康唑耐藥的菌株。詳見表3。

表26種抗真菌藥物對新生隱球菌的MIC 值(μg/mL)

Table2MIC values of 6 kinds of antifungal agents againstC.neoformans(μg/mL)

抗真菌藥物MIC范圍MIC50MIC90MIC幾何均數(shù)5-氟胞嘧啶0.5～32242.32泊沙康唑0.015～0.50.120.250.09伏立康唑0.008～0.250.030.060.039伊曲康唑<0.015～0.50.060.120.053氟康唑0.12～32483.28兩性霉素B0.12～4110.75

表3304株新生隱球菌對5種抗真菌藥物的藥敏結果[%(株)]

Table3Antifungal susceptibility of 304 strains ofC.neoformansto 5 antifungal agents (%[No. of isolates])

抗真菌藥物敏感劑量依賴性敏感耐藥5-氟胞嘧啶95.39(290)4.28(13)0.33(1)伏立康唑98.68(300)0.0(0)1.32(4)伊曲康唑99.67(303)0.33(1)0.00(0)氟康唑97.04(295)2.96(9)0.00(0)兩性霉素B98.68(300)0.0(0)1.32(4)

注：泊沙康唑由于無體外藥敏試驗解釋，在此不進行判斷

3 討論

新生隱球菌屬條件致病菌，隨呼吸經肺部侵入人體，由血液播撒至腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和關節(jié)。該菌的發(fā)病與免疫力低下，尤其是HIV 感染有密切的關系。本研究中，檢出新生隱球菌的標本類型以腦脊液和血液為主，占94．73%，其次為骨髓(11例，占3．62%)。據(jù)報道，新生隱球菌在廣西[5]、云南[6]以及長沙[7]地區(qū)艾滋病患者骨髓標本中的檢出率為2%～2．65%，與本研究結果基本一致。而在非艾滋病患者中[8-10]尚無骨髓檢出新生隱球菌的報道，可能與艾滋病患者免疫力低下，新生隱球菌更易侵犯骨髓所致，提示艾滋病患者可聯(lián)合采集腦脊液、血液和骨髓標本進行培養(yǎng)，以提高新生隱球菌的檢出率。

在艾滋病合并隱球菌性腦膜炎的患者中，治療初始階段就使用兩性霉素B 的患者，較初始時不使用此藥治療的患者死亡風險更低[11]。因此在艾滋病合并隱球菌感染的臨床路徑中，治療首選藥物推薦兩性霉素B 和5-氟胞嘧啶[2]。本研究中兩性霉素B對304 株新生隱球菌的MIC 范圍為0．12～4 μg/mL，MIC50和幾何均數(shù)(1 μg/mL 和0．75 μg/mL)均高于國內外的部分小樣本文獻[12-15]報道，如華東地區(qū)(96 株，MIC50為0．25 μg/mL，幾何均數(shù)為0．302 μg/mL)[9]，上海(35 株，MIC50為0．125 μg/mL，幾何均數(shù)為0．26 μg/mL)[16]，美國和日本(26 株，MIC50為0．0625 μg/mL)[17]。本研究的結果與國內[7-8]和國外[10，18-19]等檢測樣本量均大于100株的MIC50和幾何均數(shù)結果較一致。Espinel-Ingroff等[20]對全球3 590株新生隱球菌進行藥敏研究，結果顯示，兩性霉素B的MIC為2 μg/mL的菌株占0．95%(34株)，MIC為4的菌株占0．084%(3株)，與本次研究結果相近，提示擴大新生隱球菌藥敏實驗的樣本量，能更全面地反映新生隱球菌對抗真菌藥物的敏感性。在本研究中，有4株新生隱球菌兩性霉素B 的MIC≥2 μg/mL，其中有1株為4 μg/mL，屬罕見情況，因此對此4株菌抗真菌藥物藥物敏感性進行了復檢，復檢與初檢結果一致。出現(xiàn)此種情況可能與艾滋病患者播散性新生隱球菌的復發(fā)率高，反復使用兩性霉素B 治療有關，提示高耐藥株出現(xiàn)可能是無藥物選擇壓力下的一種宿主反應[3]。

在本研究中，氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的MIC50、MIC90和幾何均數(shù)均稍低于非HIV 感染性新生隱球菌有關研究[8-9]結果，與亞洲多中心的研究[21]結果一致，氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑對艾滋病患者分離的新生隱球菌菌株的MIC 值與非艾滋病患者分離的菌株差異無統(tǒng)計學意義，但是艾滋病患者MIC 幾何均數(shù)均小于非艾滋病患者。

本次研究以假絲酵母菌臨床菌株體外藥敏試驗解釋為藥敏折點，對新生隱球菌進行判斷，5種抗隱球菌藥物敏感率均達到95% 以上，伊曲康唑最敏感，敏感率達到99% 以上，遠高于相關文獻[3，7，9，21]報道。