王巧雪，程 卉，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

自噬是一種程序性死亡方式，是進(jìn)化過(guò)程中高度保守和至關(guān)重要的自我保護(hù)系統(tǒng)[1]。自噬發(fā)生過(guò)程中，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，代謝降解受損的細(xì)胞器，為細(xì)胞提供新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量[2-3]。自噬作為抗腫瘤藥物治療的潛在作用靶點(diǎn)近年來(lái)已得到確認(rèn)，在腫瘤不同時(shí)期發(fā)揮著促生存或促死亡的不同作用。

膠質(zhì)瘤被認(rèn)為是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性腦腫瘤，年發(fā)病例數(shù)約為10萬(wàn)人，占所有原發(fā)性腦腫瘤的54%[4]。在過(guò)去的50年里，腫瘤的治療取得重大進(jìn)展，但在膠質(zhì)瘤治療方面改進(jìn)甚少。膠質(zhì)瘤患者的中位生存時(shí)間僅有12～14個(gè)月，5年生存率低于5%[5]?？焖俚脑鲋澈蜔o(wú)法控制的侵襲一直是清除膠質(zhì)瘤的障礙，雖然有效治療方案在被不斷探索，但大多數(shù)治療方案的療效是有限的。因此尋找安全有效的化學(xué)治療藥物是目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

中藥藤黃分布于泰國(guó)、柬埔寨、印度和中國(guó)南部地區(qū)，傳統(tǒng)用于消腫、化瘀、止血等[6]。新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)是從藤黃中提取的主要活性化合物之一，近年來(lái)GNA的抗腫瘤作用已被人們認(rèn)可。研究結(jié)果表明GNA具有廣譜和顯著的抗腫瘤活性，其機(jī)制與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生不同的細(xì)胞死亡方式而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究GNA抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用是否與誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞自噬有關(guān)。

1 材料

1.1 細(xì)胞和試藥 U87細(xì)胞：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；GNA(純度99.0%，批號(hào) 20170503)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清、鏈霉素、青霉素：美國(guó)Gibico公司；噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)和吖啶橙(acridine orange，AO)：美國(guó)Sigma公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、酵母自噬基因6同系物(Beclin-1)一抗：美國(guó)CST公司；辣根酶過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗：北京中杉金橋公司。

1.2 主要儀器 MCO175型CO2培養(yǎng)箱：日本SANYO公司；SW-CJ1F型潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；CK2型倒置顯微鏡、熒光顯微鏡：日本Olympus公司；SpectraMax M2e型多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Gel DOC XR凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；FC500流式細(xì)胞儀：美國(guó)Beckman公司。

2 方法

2.1 U87細(xì)胞培養(yǎng) 將U87細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM(含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，相對(duì)飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次，傳代比例為1∶3，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整成濃度為4×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL，接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并且設(shè)空白組和對(duì)照組。過(guò)夜確定細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好后，實(shí)驗(yàn)組按梯度加入不同濃度的GNA藥液(0、1、2、4、8、16、32 μmol/L)，分別孵育24、48 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育箱避光孵育4 h后，小心吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩。用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm的每孔光密度(optical density，OD)值。采用公式計(jì)算GNA對(duì)細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞活力=(A樣品-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%，A樣品為實(shí)驗(yàn)組OD值；A空白為空白組OD值；A對(duì)照為對(duì)照組OD值。

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察 經(jīng)胰酶消化后，U87細(xì)胞以4×104/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL，待貼壁生長(zhǎng)至80%～90%的密度，對(duì)照組換成完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組換用含有4 μmol/L GNA的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 MDC熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬泡的形成 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞消化，細(xì)胞以每孔2×105接種到6孔板中，吸棄各孔舊培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組，正常組加入完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同GNA(1、2、4 μmol/L)處理，培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，每孔加入50 μmol/L的MDC染料500 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，再用PBS清凈，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)MDC標(biāo)記的綠色熒光聚集點(diǎn)的強(qiáng)度。

2.5 AO染色流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察酸性囊泡細(xì)胞器(acidic vesicle organelles，AVO)的數(shù)量變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約5×106個(gè)細(xì)胞，分別加入不同濃度的GNA(1、2、4 μmol/L)處理24 h，胰酶消化，離心，收集細(xì)胞。用PBS清洗3遍，用1 μg/mL的AO染料，避光染色30 min，PBS清凈后重懸，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)AVO數(shù)量。

2.6 Western blot法檢測(cè)U87細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá) 將U87細(xì)胞以每孔5×106個(gè)細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待密度長(zhǎng)到70%～80%，不同濃度GNA(1、2、4 μmol/L)處理24 h，收集在RIPA裂解緩沖液，提取總蛋白，BCA測(cè)定法定量每種樣品的濃度。通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離總蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，室溫下牛奶封閉3 h，振蕩器上一抗4 ℃震蕩過(guò)夜，用TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，孵育2 h，置于Protein Simple Alpha凝膠成像系統(tǒng)記錄圖片并分析蛋白表達(dá)變化。

3 結(jié)果

3.1 GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度GNA處理細(xì)胞24、48 h后，U87細(xì)胞的存活率隨劑量和時(shí)間呈現(xiàn)依賴(lài)性下降。GNA作用膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞24 h的IC50為2.63 μmol/L，GNA作用膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞48 h的IC50為1.62 μmol/L。見(jiàn)圖1。

圖1 GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活力的影響

3.2 不同濃度GNA處理膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài) 對(duì)照組細(xì)胞貼壁牢固，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，觸角明顯，胞體透明，折光性好。GNA組細(xì)胞間隙增寬，無(wú)特定形態(tài)，細(xì)胞觸角收縮，皺縮變圓，貼壁不牢，胞內(nèi)顆粒增多，折光度下降。見(jiàn)圖2。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B. 2.0 μmol/L GNA組

圖2倒置顯微鏡下觀(guān)察GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞形態(tài)的影響(10×10倍)

3.3 不同濃度GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞自噬泡形成的影響 實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量MDC標(biāo)記的熒光顆粒聚集，且熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)方式增加；而對(duì)照組處理中只觀(guān)察到少量自噬囊泡，表明GNA增加自噬過(guò)程中自噬泡的積累。見(jiàn)圖3。

3.4 GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞AVO數(shù)量的影響 通過(guò)用流式細(xì)胞儀分析，在GNA處理的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中檢測(cè)到大量的AVO，并以劑量依賴(lài)性方式增加紅染AVO的比例，這表明GNA可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。見(jiàn)圖4。

3.5 不同濃度GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Becline-1表達(dá)的影響 GNA(1、2、4 μmol/L)作用膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞24 h后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈劑量依賴(lài)性升高，細(xì)胞內(nèi)Beclin-1蛋白表達(dá)量呈劑量依賴(lài)性增加。結(jié)果提示GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖抑制作用可能與細(xì)胞自噬途徑相關(guān)。見(jiàn)圖5。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B.1.0 μmol/L GNA組；C. 2.0 μmol/L GNA組；D. 4.0 μmol/L GNA組

圖3不同濃度GNA對(duì)U87細(xì)胞自噬泡形成的影響(MDC熒光染色，10×20倍)

注：與GNA 0 μmol/L組比較，*P<0.05

4 討論

中藥藤黃的抗腫瘤成分主要是藤黃酸和GNA，與藤黃酸相比，GNA具有抗癌譜廣、作用強(qiáng)、毒性低、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，有望成為新結(jié)構(gòu)類(lèi)型的抗腫瘤藥物[7]。近年來(lái)本課題組著力于GNA抗腫瘤作用的研究，現(xiàn)有研究結(jié)果表明GNA能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如肝癌細(xì)胞、黑色素瘤B16細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、宮頸癌U251細(xì)胞等，體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明GNA有顯著的抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用可能與腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬有關(guān)[8-11]。

注：A. 0 μmol/L GNA組；B.1.0 μmol/L GNA組；C. 2.0 μmol/L GNA組；D. 4.0 μmol/L GNA組；與0 μmol/L GNA組比較，*P<0.05

自噬是細(xì)胞通過(guò)典型雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞器、難降解物質(zhì)和部分胞漿，形成自噬體，再運(yùn)送至溶酶體與之融合，代謝降解受損的細(xì)胞器，為細(xì)胞提供新?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的過(guò)程，是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的現(xiàn)象[12]。MDC是一種趨向溶酶體的嗜酸性活細(xì)胞染料，可以特異性地標(biāo)記成熟的自噬泡[13]。形成AVO是自噬的特征之一，AVO可以在細(xì)胞自噬過(guò)程中與AO結(jié)合，可以將細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色成明亮的綠色，使AVO呈鮮紅色[14]。酸性小泡的形成和促進(jìn)自噬小體的運(yùn)輸過(guò)程中，LC3蛋白的參與起重要作用[15]。在自噬發(fā)生時(shí)，LC蛋白由LC3-Ⅰ形式轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ形式，LC3-Ⅱ在組裝溶酶體、自噬體及最后誘導(dǎo)激活自噬中起重要作用，因此在自噬分子水平的研究中，LC蛋白的轉(zhuǎn)化具有重要意義[16]。Beclin-1被明確是調(diào)控自噬的正因子，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化大多存在Beclin-1雜合性缺失，在自噬過(guò)程中，Beclin-1不僅有利于吞噬泡的形成從而促進(jìn)自噬體的形成，另外還有助于自噬體的成熟[17]。

本研究從細(xì)胞自噬的角度研究GNA對(duì)類(lèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果提示在一定的范圍內(nèi)GNA對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞呈現(xiàn)劑量與時(shí)間依賴(lài)性。經(jīng)MDC熒光染色和AO染色的流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，GNA處理24 h后的細(xì)胞內(nèi)，自噬泡和酸性囊泡細(xì)胞器增加；經(jīng)Western-blot檢測(cè)，GNA處理的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈劑量依賴(lài)性升高，Beclin-1蛋白表達(dá)量均呈劑量依賴(lài)性增加，提示膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖抑制可能與細(xì)胞自噬途徑相關(guān)。

本研究表明，GNA引起膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞自噬過(guò)程的發(fā)生，而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬也正是GNA發(fā)揮腫瘤抑制作用的機(jī)制之一，有關(guān)GNA誘導(dǎo)自噬的相關(guān)途徑尚待進(jìn)一步研究。